[發明專利]高脂質含量葡萄藻新品系的育種方法

無效

• 申請號: 201310066979.8
• 申請日: 2013-03-03
• 公開（公告）號: CN103146680A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發明（設計）人: 汪志平;于金鑫;劉新穎;王冬云;馬麗芳
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N13/00
• 分類號: C12N13/00;C12N15/01;C12R1/89
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 周世駿

1.一種高脂質含量葡萄藻新品系的育種方法，其特征在于，該方法是：將葡萄藻液置于離心管，加入微粒型的黃單胞多糖，然后置于冰水浴中，并用超聲波將由幾十至上百個細胞形成的葡萄藻集落制備成單細胞；單細胞化的葡萄藻經化學誘變劑甲基磺酸乙酯誘變及低熔點瓊脂糖固定化培養后，利用尼羅紅顯微熒光活體篩檢技術獲得高脂質含量的葡萄藻候選突變體；再經擴大培養和脂質含量測定選育出高脂質含量的葡萄藻新品系；所述的低熔點瓊脂糖是指在多糖鏈上引入羥乙基后的瓊脂糖；所述的高脂質含量的葡萄藻是指脂質含量比其出發品系至少高30%的葡萄藻。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，具體包括以下步驟：

(1)?取4?mL待測葡萄藻液于5?mL離心管中，再加入微粒型黃單胞多糖，并置于冰水浴中預冷；微粒型黃單胞多糖的添加量為5粒，0.2?mg/粒，共1?mg；

(2)?預冷藻液經超聲波處理10?s后，在光學顯微鏡下觀察葡萄藻集落是否已被分散成單細胞；?

(3)?若沒有，則用每次5?s的超聲波進行多次處理，直至被分散成單細胞，由此計算被測葡萄藻液適宜的超聲處理時間T=10+5×n，單位為s，其中n為每超聲處理5?s的次數；

(4)?藻液經6000?rpm離心10?min，獲得的藻細胞用甲基磺酸乙酯誘變處理；

(5)?6000?rpm離心10?min后，將藻細胞轉入培養液中，并使其560?nm的光密度D₅₆₀為0.05；轉入10?ml的PE管中，每管裝4?ml，并置于37℃水浴中保溫；

(6)?用低熔點瓊脂糖固定細胞，并置于25℃光照培養箱中培養30?d；

(7)?將含藻細胞的低熔點瓊脂糖凝膠切成1?mm厚的圓片，并置于含2%(V/V)二甲基亞砜和1?μg/mL尼羅紅的染色液中于黑暗下40℃染色10?min；

同時，按上述步驟制備對照組，其中步驟(4)用于處理藻細胞的是不含甲基磺酸乙酯的0.5?M磷酸緩沖液，其pH值為7.0；

(8)?取1片染色后的對照組藻細胞的凝膠片并展到載玻片上，置于熒光顯微鏡上用藍光激發，通過調節熒光顯微鏡上藍色激發光電流調控旋鈕調節激發光強度直至能看到具紅色熒光的葡萄藻細胞，再通過調節熒光顯微鏡上藍色激發光電流調控旋鈕逐漸調低激發光的強度，至顯微視野中藻細胞的熒光剛好消失，記下電流表上表征此時藍色激發光強度的電流值I，繼續調節藍色激發光電流調控旋鈕使電流表的電流值降至2I/3，保持此時旋鈕的位置不變；

(9)?將經甲基磺酸乙酯誘變的藻細胞的凝膠片用尼羅紅染色后展到載玻片上，并置于熒光顯微鏡上用調節好光強度的藍光激發，當觀察到具紅色熒光的藻細胞時，用接種針挑取相應的凝膠塊，并置于含1?ml培養液的2?ml?PE管中，用頻率為20?kHz、發射功率為100?W、以1?s?/?1?s?的開/關間歇的超聲波處理20?s以粉碎凝膠塊，再置于25℃光照培養箱中培養30?d，即獲得高脂質含量的葡萄藻新品系。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，在步驟（2）或（3）中制備葡萄藻單細胞時，設定超聲波儀的頻率為20?kHz，發射功率為100?W，將Φ2型變幅桿前端2?cm浸入預冷藻液，以1?s?/?1?s?的開/關間歇超聲處理15~25?s。

4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，在步驟（6）中，使用與藻液等體積的濃度為2%、65℃的低熔點瓊脂糖進行固定藻細胞。

5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，在步驟（4）中，所述誘變處理是：將藻細胞放入濃度為3%的甲基磺酸乙酯溶液處理6?h，再避光3h。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述甲基磺酸乙酯溶液以pH7.0的0.5?M磷酸緩沖液作為溶劑。