[發明專利]一種高脂質含量葡萄藻新品系的選育方法

無效

• 申請號: 201310066949.7
• 申請日: 2013-03-03
• 公開（公告）號: CN103146678A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發明（設計）人: 汪志平;馬麗芳;劉新穎;于金鑫
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N13/00
• 分類號: C12N13/00;C12N15/01;C12R1/89
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 周世駿

技術領域

本發明屬于能源微藻——葡萄藻開發利用的技術，特別涉及一種高脂質含量葡萄藻新品系的選育方法。

背景技術

葡萄藻（Botryococcus）是一種世界廣布的能源微藻，該藻因脂質含量通常為其細胞干重的25-35%，普遍高于小球藻等其它微藻，且脂質的組成和結構與化石原油的也最為相近，而被譽為“油藻”，以其生產航空燃油等高品質燃料一直是近年來全球生物能源領域的研發熱點之一[Metzger?&?Largeau.?Botryococcus?braunii:?a?rich?source?for?hydrocarbons?and?related?ether?lipids.?Appl?Microbiol?Biotechnol.?2005,?66:?486–496;?Sakamoto,?et?al.?Optimization?of?light?for?growth,?photosynthesis,?and?hydrocarbon?production?by?the?colonial?microalga?Botryococcus?braunii?BOT-22.?Bioresource?Technology.?2012,?110:?474?479.]。種子工程是農業與生物產業的基礎，選育優良種質的重要性不僅在螺旋藻、小球藻等經濟微藻的產業化進程中得到了充分體現，在推進水稻、小麥、玉米等農作物高產、優質、低成本生產中更是表現得淋漓盡致。值得指出的是，有關葡萄藻優良種質選育雖已受到國內外的高度重視，但在葡萄藻遺傳育種研究方面迄今近乎空白，而從自然界分離藻株的適應性差、脂質產率低等問題，也正是制約著葡萄藻至今尚未能得到商業化開發應用的主要瓶頸。因此，迫切需要運用誘發突變等現代育種技術，對從自然界分離獲得的葡萄藻種進行遺傳改良，顯著提高其對人工培養條件的適應性、生長速率及含脂量，這對實現葡萄藻的低成本工業化培殖并以之生產品質和價格等均能與化石燃油相競爭的生物燃油，推進葡萄藻制油的產業化進程，具有重要意義。目前，開展高脂質含量葡萄藻新品系選育主要面臨著以下兩方面的技術難題：1、葡萄藻呈由幾十至幾百個細胞聚集而成的集落狀，其誘變頻率及突變體篩選效率遠低于小球藻等呈單細胞態的微藻；2、還沒有建立適于篩選高脂質含量突變體的選擇壓力，只能先將藻液涂于平板分離培養，再將大量的克隆逐一接種到培養液擴大培養后再進行脂質測定，因而篩選的工作量大、效率低、成功率小。因此，迫切需要建立一種簡便、高效、高通量的高脂質含量葡萄藻新品系的培育方法。

發明內容

本發明要解決的技術問題是，克服現有技術中的不足，建立一種高脂質含量葡萄藻新品系的選育方法。

為解決技術問題，本發明的解決方案是：

提供一種高脂質含量葡萄藻新品系的選育方法，該方法是：將葡萄藻液置于離心管，加入微粒型的黃單胞多糖，然后置于冰水浴中，并用超聲波將由幾十至上百個細胞形成的葡萄藻集落制備成單細胞；單細胞化的葡萄藻經紫外線輻射誘變及低熔點瓊脂糖（low?melting?agarose）固定化培養后，利用尼羅紅顯微熒光活體篩檢技術獲得高含脂量的葡萄藻候選突變體；再經擴大培養和脂質含量測定選育出高脂質含量的葡萄藻新品系；所述的低熔點瓊脂糖是指在多糖鏈上引入羥乙基后的瓊脂糖（低熔點瓊脂糖系常用的生物培養與分子操作實驗素材，其熔點約為65℃，比普通瓊脂糖的熔點低30℃左右）；所述的高脂質含量的葡萄藻是指脂質含量比其出發品系至少高30%的葡萄藻。

本發明具體包括以下步驟：

(1)?取4?mL待測葡萄藻液于5?mL離心管中，再加入微粒型黃單胞多糖，并置于冰水浴中預冷；微粒型黃單胞多糖的添加量為5粒，0.2?mg/粒，共1?mg；

(2)?預冷藻液經超聲波處理10?s后，在光學顯微鏡下觀察葡萄藻集落是否已被分散成單細胞；?

(3)?若沒有，則用每次5?s的超聲波進行多次處理，直至被分散成單細胞，由此計算被測葡萄藻液適宜的超聲處理時間T=10+5×n，單位為s，其中n為每超聲處理5?s的次數；

(4)?用孔徑為0.45?μm的無菌濾膜過濾藻液使藻細胞均勻平鋪于濾膜上，并用紫外線進行誘變處理；

(5)?將濾膜上的藻細胞轉移至培養液中，并使其560?nm的光密度D₅₆₀為0.05，轉入10?ml的PE管中，每管裝4?ml，并置于37℃水浴中保溫；

(6)?用低熔點瓊脂糖固定細胞，并置于25℃光照培養箱中培養30?d；