[發明專利]用于重金屬鉛的快速檢測的核酸熒光探針及其檢測方法

無效

• 申請號: 201310066183.2
• 申請日: 2013-03-01
• 公開（公告）號: CN103160504A
• 公開（公告）日: 2013-06-19
• 發明（設計）人: 周培;邢海波;戢太云;詹學佳
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/10;C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 上海交達專利事務所 31201
• 代理人: 王毓理;王錫麟

1.一種用于重金屬鉛的快速檢測的核酸熒光探針，其特征在于，其DNA序列由以下：

A)5'-FAM-GCACTCACTATrAGGAAGA(-Dabcy1)GATG-3'，以及

B)3'-Dabcy1---CGTGAGTGATA(AAGCTGGCCGAGCC)TCTTCTCTAC-5'所組成。

2.一種制備權利要求1所述探針的方法，其特征在于，用DNA/RNA合成儀分別合成設計好熒光標記位置的DNAzyme8-17底物鏈和酶鏈，將酶：底物：水=1:1:78的體積比配成的混合液置于PCR儀中95℃退火15min，非變性凝膠電泳分離純化，切下雙鏈條帶，氯化鈉溶解后過ZipTipC₁₈微量層析柱回收雙鏈產物，得到雙鏈熒光探針。

3.一種基于權利要求1所述探針的重金屬鉛快速定性檢測方法，通過對比探針中加入其它五種金屬離子Zn²⁺、Cd²⁺、Cu²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺在260nm處的熒光強度，得到所述探針對于鉛離子的特異性結果，并通過熒光強度變化實現Pb²⁺的定性檢測。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征是，所述的定性檢測是指：在室溫下將5.0×10^-7mol/L的探針溶液10μL、超純無菌水490μL均勻混合，掃描探針的背景熒光強度；隨后分別取40μL濃度為5.0×10^-6mol/L的鎘、鋅、鎂、銅、錳、鉛6種二價金屬鹽的溶液滴加到5.0×10^-7mol/L的探針溶液10μL、超純無菌水450μL均勻混合的探針溶液中，掃描熒光強度；根據探針中加入不同的金屬離子以后的熒光強度變化，確定探針對Pb²⁺的特異性，從而實現Pb²⁺的快速定性檢測。

5.一種基于權利要求1所述探針的重金屬鉛快速定量檢測方法，通過對探針中加入已知濃度的Pb²⁺，并且在260nm處掃描熒光強度，從而構建出Pb²⁺濃度與熒光強度之間檢測體系及其線性關系曲線；隨后將待測樣品在260nm處掃描出的熒光強度值帶入線性關系曲線，從而得到Pb²⁺的濃度并實現定量檢測。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征是，所述的探針對不同濃度的特異性的含有不同濃度的Pb²⁺離子的檢測體系是指：將熒光探針的初始濃度設計為2.5×10^-7mol/L、1.25×10^-7mol/L兩個濃度梯度，Pb²⁺的初始濃度設計為1.0×10^-5mol/L、7.5×10^-6mol/L、5.0×10^-6mol/L、2.5×10^-6mol/L、1.25×10^-6mol/L、1.0×10^-6mol/L、5.0×10^-7mol/L、2.5×10^-7mol/L、1.25×10^-7mol/L、1.0×10^-7mol/L10個濃度梯度，室溫下向10μL探針與450μL超純水混合液中分別滴加40μL各濃度的Pb²⁺溶液。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征是，所述的線性關系曲線是指：以Pb²⁺的μM濃度為橫坐標x，260nm處掃描出的熒光強度為縱坐標y，得到1μM以下的曲線為y＝118.11x+57.268；1μM以上的曲線為y=96.68x+82.37。