[發明專利]一種攜帶PTD的抗人CD3單鏈抗體的制備方法

無效

• 申請號: 201310066004.5
• 申請日: 2013-03-04
• 公開（公告）號: CN103173478A
• 公開（公告）日: 2013-06-26
• 發明（設計）人: 王驪麗;高棟;耿信篤
• 申請（專利權）人: 西北大學
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C12N15/70;C07K19/00;C07K1/20;C07K1/16
• 代理公司: 西安西達專利代理有限責任公司 61202
• 代理人: 謝鋼

1.一種攜帶PTD的抗人CD3單鏈抗體的制備方法，包括以下步驟：

（1）天然抗CD3抗體基因與肽段-PTD基因融合得到攜帶PTD抗CD3單鏈抗體基因，將攜帶PTD抗CD3單鏈抗體基因插入E.coli表達載體pBV220表達，獲得攜帶PTD的抗人CD3單鏈抗體重組菌；

（2）PTD-CD3單鏈抗體重組菌在E.coli中的表達產物為含PTD-CD3的包涵體，將包涵體溶解于6.0～8.0?mol/L脲溶液，使用結構式（I）或（II）所示的高效疏水色譜介質進行復性與純化，收集色譜餾分，得到復性與純化的PTD-CD3；

?（I）

其中n=10～25

（II）

空白基質為孔徑為20-30?nm，粒徑為5-10μm的大孔硅膠微球；

色譜條件：流動相A液為2～3?mol/L?(NH₄)₂SO₄，20～50?mmol/L?KH₂PO₄，pH?7～8；流動相B液為20～50?mmol/L?KH₂PO₄，pH?7～8；流速為1.0～5.0?mL/min；采用0-100%?B液線性梯度洗脫，檢測波長280?nm；

（3）將PTD-CD3單鏈抗體用體積排阻色譜除鹽進一步純化。

2.根據權利要求1所述的攜帶PTD的抗人CD3單鏈抗體的制備方法，其特征在于：步驟（1）中，肽段-PTD序列為GRKKRRQRRRPPQ，獲得的PTD-CD3單鏈抗體重組菌為pBV220/PTD-CD3/DH5α。

3.根據權利要求1所述的攜帶PTD的抗人CD3單鏈抗體的制備方法，其特征在于：步驟（2）中，含PTD-CD3的包涵體用強變性劑6.0～8.0?mol/L脲溶解，放置12?小時以上分離，得到含PTD-CD3包涵體變性抽提液。

4.根據權利要求1所述的攜帶PTD的抗人CD3單鏈抗體的制備方法，其特征在于：步驟（2）中，結構式（I）所示的高效疏水相互作用色譜固定相中n等于20。

5.根據權利要求1所述的攜帶PTD的抗人CD3單鏈抗體的制備方法，其特征在于：步驟（2）中，高效疏水相互作用色譜柱分別為10×20?mm?I.D.餅型分析型或10×50?mm?I.D.半制備色譜柱，裝填色譜柱的壓力大于?40?MPa。

6.根據權利要求1所述的純化PTD-CD3的制備方法，其特征在于，步驟（3）中的體積排阻色譜介質為Superdex75R。