[發明專利]尿液中(S)-NNAL和(R)-NNAL的高效液相色譜-質譜-質譜聯用檢測方法

有效

• 申請號: 201310065977.7
• 申請日: 2013-03-01
• 公開（公告）號: CN103149297A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發明（設計）人: 蔣舉興;段焰青;王明鋒;夏建軍;劉亞;張敏
• 申請（專利權）人: 紅云紅河煙草（集團）有限責任公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 昆明協立知識產權代理事務所(普通合伙) 53108
• 代理人: 馬曉青

技術領域

本發明屬于煙草特有亞硝胺在尿液中的生物標志物理化檢驗技術領域，具體涉及尿液中(S)-NNAL和(R)-NNAL的高效液相色譜-質譜-質譜聯用檢測方法。

背景技術

煙草特有亞硝胺（TSNAs）是煙草內源性生物堿與硝酸鹽和亞硝酸鹽通過亞硝化作用而產生，只存在于煙草、煙草制品和卷煙煙氣中。近年來，隨著吸煙與健康問題受到人們的廣泛關注，國內外對于煙氣中各種有害化學成分的研究也日益深入。由于煙草特有亞硝胺中的4-(甲基亞硝胺基)-1-(3-吡啶基）-1-丁酮(NNK）對動物可能有致癌性，因此，現在煙草行業以及衛生機構等迫切需要建立一種準確評價不同人群對NNK暴露程度的方法，而生物標志物法是一種公認且有效的監測NNK暴露人群暴露程度的方法。

在NNK分子中沒有手性碳原子，因此NNK分子沒有對映異構體，但NNK分子中有一個羰基，該羰基隨著NNK進入人體后被羰基還原酶還原為羥基，生成一對NNAL對映異構體，分別為(S)-NNAL和(R)-NNAL，部分NNAL可以進一步被糖苷化物為NNAL糖苷化合物（包括NNAL-O-Glucuronide和NNAL-N-Glucuronide），這些代謝產物主要通過尿液和其它體液排出體外，研究還發現在吸煙者的尿液中不含游離形式的NNK。

由于人體本身就是一個動態的不對稱化學反應有機系統，所以卷煙煙氣中的NNK被加氫還原酶還原生成(S)-NNAL和(R)-NNAL的比例以及進一步代謝產物比例必然反映出人體相關器官的解毒能力以及受到NNK的損害程度，因此尿液中(S)-NNAL、(R)-NNAL、(S)-NNAL-糖苷化合物和(R)-NNAL-糖苷化合物的含量以及比例一直受到關注。2002年，Hecht等的研究發現揭示，人體尿樣中游離形式的(R)-NNAL的含量略約是(S)-NNAL含量的1.1倍，但人尿樣中(R)-NNAL糖苷化合物的含量是(S)-NNAL糖苷化合物含量的的兩倍左右，這說明(S)-NNAL和(R)-NNAL的進一步代謝途徑差別很大，同時也說明人體對(S)-NNAL有一種立體選擇性的保留能力，特別是老鼠在攝入NNK后相當長一段時間內其肺部(S)-NNAL的比例也遠高于(R)-NNAL。其他學者的研究結果也顯示吸煙的肺癌患者尿樣中(S)-NNAL與(R)-NNAL的比值明顯大于普通吸煙者。結合流行病學調查分析結果，人們推測人肺臟內可能有(S)-NNAL的受體，此受體可特異性結合(S)-NNAL，這可能就是吸煙吸收NNK導致肺癌的原因之一。

由于中式卷煙每支卷煙煙氣中釋放的NNK只有幾個納克，而NNK進入人體后又被代謝為多種物質，加之尿樣基質復雜，所以尿樣中的(S)-NNAL和(R)-NNAL的檢測非常困難，國內外許多相關行業都無法開展尿樣中(S)-NNAL和(R)-NNAL的檢測工作。在這種背景下，許多相關行業迫切需要建立一種能夠快速準確測定人體尿樣中(S)-NNAL和(R)-NNAL的含量和比例的方法，以便為肺癌的早期檢測等提供進一步參考信息。

發明內容：

本發明的目的在于針對現有方法很難開展尿樣中(S)-NNAL和(R)-NNAL的檢測工作的不足，提供一種尿液中(S)-NNAL和(R)-NNAL的高效液相色譜-質譜-質譜聯用檢測方法，為評估個體對煙氣中NNK的暴露程度提供一種科學的判定方法，該方法具有檢測限低、穩定性好、快速準確等優點。

本發明的目的通過下述技術方案予以實現。

尿液中(S)-NNAL和(R)-NNAL的高效液相色譜-質譜-質譜聯用檢測方法，包括以下步驟：

①用測定旋光并比對的方法確定(S)-NNAL和(R)-NNAL的構型并作為參照，或用Mosher方法確定(S)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯和(R)-NNAL-甲基-d3-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯的構型并作為參照；

②配制含有rac-NNAL和氘代rac-NNAL-甲基-d3的混合標準溶液，再進行Mosher衍生化，然后對衍生化以后的混合標準溶液進行HPLC-MS-MS分析;用確定構型后的(S)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯和(R)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯通過保留時間確定相應的色譜峰保留時間，采用內標法分別建立(S)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯對其相應內標的標準溶液工作曲線和(R)-NNAL-(S)-(+)-α-甲氧基-α-三氟甲基苯乙酸酯對其相應內標的標準溶液工作曲線；