[發明專利]重組人胰島素原的復性與純化方法

無效

• 申請號: 201310065815.3
• 申請日: 2013-03-04
• 公開（公告）號: CN103172727A
• 公開（公告）日: 2013-06-26
• 發明（設計）人: 王驪麗;吳溪;周慧芳;袁潔
• 申請（專利權）人: 西北大學
• 主分類號: C07K14/62
• 分類號: C07K14/62;C07K1/16
• 代理公司: 西安西達專利代理有限責任公司 61202
• 代理人: 謝鋼

技術領域

本發明涉及一種利用高效體積排阻色譜(HPSEC或SEC)法復性與純化重組人胰島素原的方法，屬于生物醫藥中變性蛋白復性技術領域。

背景技術

胰島素原（Proinsulin，PI）是由86個氨基酸組成的單鏈肽，其C肽的兩端各自通過兩個堿性氨基酸殘基與胰島素A鏈的N末端和B鏈的C末端相連。胰島素原分子的折疊卷曲保證了三對二硫鍵的正確對接。在胰島素制備中，采用胰島素原法直接酶切后獲得有活性的胰島素已經是一種成熟的方法。因此，獲得高質量回收率的具有活性重組人胰島素原（簡稱：rhPI）是制備重組人胰島素的前提。

Robert?B.?M等[Robert?B.?M,?et?al,?Protein?Expres?Purif,?1999,?15:?308-313]曾利用離子交換色譜（IEC）法和親和色譜（AFC）法對rhPI包涵體蛋白進行純化，之后用稀釋法復性、酶切獲得產物用RPLC法分析。而?Gusarova?V等[Gusarova?V,?et?al,?J?Chromatogr?A.?2007,?1176:?157-162]報道了先利用稀釋法復性rhPI，再分別用IEC法和SEC法進行兩步純化后，通過酶切轉換為胰島素。上述方法均利用稀釋法復性，難于大規模進行蛋白藥物的制備。

發明內容

本發明的目的在于提供的一種高效、快速的復性與純化重組人胰島素原的方法，能夠提高重組人胰島素原的質量回收率和純度，并可直接用于酶切為胰島素，適用于胰島素的規模化生產。

本發明實現過程如下：

重組人胰島素原的復性與純化方法，包括以下步驟：

（1）在大腸桿菌（E.coli）中表達的重組人胰島素原（rhPI）的菌體細胞經離心、超聲破碎后分別用緩沖液I和II洗滌、離心溶解于強變性緩沖液中得到含有重組人胰島素原的變性抽提液；

所述緩沖液I為10～20?mmol/L?PBS，0.5～1?mmol/L?EDTA，pH?7.0～7.5；

所述緩沖液II為0.5～2.0?mol/L脲，0.5～1?mmol/L?EDTA，0.5～1.0?mol/L?NaCl，10～20?mmol/L?PBS，pH?7.0～7.5；

所述的強變性緩沖液為6.0～8.0?mol/L脲，10～20?mmol/LDTT，0.5～1?mmol/LEDTA，pH7.0～8.0；或6～7?mol/L鹽酸胍，10～20mmol/LDTT，0.5～1mmol/LEDTA，pH7.0～8.0；

（2）將含有重組人胰島素原的變性抽提液直接進樣到流動相A（20～40?mmol/LPBS，0～8.0?mol/L脲，pH6.0～7.0）平衡的色譜柱，然后用含20～40?mmol/LPBS，pH6.0～7.0的流動相B線性梯度洗脫，流速為0.3～0.7mL/min，收集目標峰色譜餾分得到復性與純化含重組人胰島素原的色譜餾分；

（3）將步驟（2）含人胰島素原的色譜餾分直接進樣，用0～10??mmol/LPBS，pH6.0～7.0的流動相平衡的色譜柱進一步脫鹽，持續洗脫20～40?min，流速0.5～1?mL/min，得到重組人胰島素原。

上述步驟（2）中色譜柱為TSK?gel?G2000SWXL型（7.8mm×300mm）或Superde×200?10/300GL型（10?mm×300?mm）。

上述步驟（2）中所述洗脫方式可以采用流動相A平衡后，用流動相B線性梯度洗脫20～40?min，延長5～10?min。

上述步驟（3）中所述色譜柱為HiTrap?Desalting?column。

本發明的優點：本發明提供的利用脲濃度梯度體積排阻色譜對重組人胰島素原復性與純化的方法，解決了蛋白分子直接從高濃度變性劑擴散到與流動相中，而不能提供一個緩和的蛋白再折疊環境的問題，同時也克服了其他色譜方法成本高，難于放大的缺點。本發明在流動相中添加了小分子脲之后，在洗脫過程中，為蛋白再折疊提供了一個溫和的環境，促進蛋白折疊成緊密的結構，保留時間延長，復性效率和質量回收率也得到提高。并且經過脫鹽柱后更加利于后續酶切而得到胰島素，操作簡單成熟、穩定，固定相成本較低，易于控制和放大

附圖說明

圖1?復性與純化前后rhPI的SDS-PAGE分析