[發(fā)明專利]一種用于轉(zhuǎn)基因水稻PCR檢測的重組標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒及試劑盒

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310065279.7
• 申請日: 2013-03-01
• 公開（公告）號: CN103146824A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 徐俊鋒;陳笑蕓;汪小福;繆青梅;朱妍晴;朱青
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/63
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;冷紅梅

（一）技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種用于三種轉(zhuǎn)基因水稻KF6、TT51、KMD1的定性和定量檢測的重組標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，以及含有該重組標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的試劑盒。

（二）背景技術(shù)

自首例轉(zhuǎn)基因番茄“FLAVR?SAVR”于1994年在美國批準(zhǔn)商業(yè)化生產(chǎn)以來，隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)迅速發(fā)展，許多有價值的外源基因?qū)肓酥参镏?，越來越多的轉(zhuǎn)基因作物被批準(zhǔn)在不同國家和地區(qū)商業(yè)化種植。對水稻而言，目前有許多抗蟲、抗病、耐除草劑及營養(yǎng)成分改良的轉(zhuǎn)基因水稻研發(fā)成功，轉(zhuǎn)基因水稻品系：KF6、TT51和KMD1為我國擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的抗蟲Bt水稻，其中轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻華恢1號（TT51）在2009年，我國農(nóng)業(yè)部頒發(fā)了其在湖北省生產(chǎn)應(yīng)用的安全證書。

為保障在農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)出口貿(mào)易中的利益，各國相繼建立轉(zhuǎn)基因標(biāo)識制度,對轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)的準(zhǔn)確度和靈敏度提出了嚴(yán)格的要求，目前對轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品的檢測主要有蛋白質(zhì)水平檢測和核酸水平檢測，而由于核酸的提取、保存及穩(wěn)定性等方面的優(yōu)勢，使得基于核酸檢測的轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)得到快速發(fā)展,其中以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)發(fā)展得最快，轉(zhuǎn)基因作物PCR檢測方法又分為4個層次，分別為篩查檢測、基因檢測、構(gòu)建特異性檢測和轉(zhuǎn)化體特異性檢測，在日常的檢測工作中，由于轉(zhuǎn)基因樣品量較大，轉(zhuǎn)基因的篩查工作顯得尤為重要，而陽性標(biāo)準(zhǔn)品的缺乏無法滿足轉(zhuǎn)基因安全監(jiān)管中篩查工作的需求，因此開發(fā)一種針對轉(zhuǎn)基因水稻篩查檢測用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子具有重要的意義。

陽性質(zhì)粒分子的概念由日本科學(xué)家Kuribara?H等于2002年提出，它是指一種含有轉(zhuǎn)基因作物檢測的目的外源基因和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的特異性擴增片段的線性化的重組質(zhì)粒分子。陽性質(zhì)粒分子的優(yōu)點主要是可以通過微生物進(jìn)行大量培養(yǎng)，且操作容易，同一個陽性質(zhì)粒分子可以同時包含多個外源目的基因，質(zhì)粒DNA提取容易且純度較高。轉(zhuǎn)基因作物陽性質(zhì)粒分子是轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的一種。開發(fā)陽性質(zhì)粒分子可以有效的解決檢測工作中缺乏有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和陽性材料的難題。

（三）發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供本發(fā)明的目的是提供一種為三種轉(zhuǎn)基因水稻KF6（科豐6號）、TT51（華恢1號）、KMD1（克螟稻）的轉(zhuǎn)化體特異性檢測用重組標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒及其應(yīng)用，滿足轉(zhuǎn)基因水稻安全監(jiān)管篩查檢測工作中的需求。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種用于轉(zhuǎn)基因水稻KF6、TT51、KMD1的定性和定量PCR檢測的重組標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，由如下方法獲得：將SEQ?ID?No.1所示的KF6側(cè)翼序列、SEQ?ID?No.2所示的TT51側(cè)翼序列、SEQ?ID?No.3所示的KMD1側(cè)翼序列和SEQ?ID?No.4所示的PLD基因依次連接獲得融合片段，再將所得融合片段克隆到載體pMD18-T中，獲得所述重組標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，記為pMD-KTK。

KF6側(cè)翼序列如下（長度454bp）：

Gatcccgaaggccaacacaataggaccggaatcctatgatgttatcccatgctaatgtatccagagcgatggcttgctttgagcactctaatttcttcaaagtaacggcgccggaggcacgacccggccagttaaggccaggagcgcatctgatccaacttaataacacattgcggacgtttttaatgtactgaattaacgccgaattaattcgggggatctggattttagtactggattttggttttaggaattagaaattttattgatagaagtattttacaaatacaaatacatactaagggtttcttataggctcaacacatgagcgaaaccctataggaaccctaattcccttatctgggaactactcacacattattatggagaaactcgagcttgtcgatcgacagatcccggtcggcatctactctatttctttgccctcggacga

TT51側(cè)翼序列如下（長度305bp）：