[發(fā)明專利]中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物研究的原代同源三細(xì)胞四維模型及構(gòu)建方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310065078.7
• 申請日: 2013-03-01
• 公開（公告）號: CN103184188A
• 公開（公告）日: 2013-07-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫長凱;李彧媛;鄭鐵錚;范明;趙慧
• 申請（專利權(quán)）人: 大連醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/079;C12N5/0793;C12Q1/02
• 代理公司: 大連非凡專利事務(wù)所 21220
• 代理人: 閃紅霞

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)與損傷修復(fù)藥物研究模型構(gòu)建技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種基于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial?cells,?E）、星形膠質(zhì)細(xì)胞（astrocytes,?A）及神經(jīng)元細(xì)胞（neuron,?N）三種基本細(xì)胞形成的中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物研究的原代同源三細(xì)胞四維模型及構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

中樞神經(jīng)系統(tǒng)是世界上最重要、最復(fù)雜的生命組織，中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病則是健康負(fù)擔(dān)和醫(yī)學(xué)難題之一，所以對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)與損傷修復(fù)藥物研究一直是生物醫(yī)藥研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，其技術(shù)瓶頸即迫切需要建立一種既可以維持細(xì)胞在體內(nèi)的正常形態(tài)及功能，又可以對其生長環(huán)境進(jìn)行簡單調(diào)節(jié)控制的細(xì)胞生長載體。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)環(huán)境雖然能完整地保留細(xì)胞的各種特征，但是過于復(fù)雜的體內(nèi)環(huán)境和體內(nèi)大量不可控因素以及動(dòng)物之間的個(gè)體差異將導(dǎo)致相關(guān)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生偏差，同時(shí)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也很難實(shí)現(xiàn)對一種細(xì)胞進(jìn)行基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)分析，這對以后的網(wǎng)絡(luò)神經(jīng)、精神藥理學(xué)研究造成了很大的障礙。另外，通過外科手術(shù)獲得的人腦與脊髓活體組織標(biāo)本，其組織活性難以保證而且多為病理組織，無法滿足深入研究（如藥物靶點(diǎn)、藥物效應(yīng)、藥物毒副作用、藥代動(dòng)力學(xué)等對比研究與評價(jià)）的需要，因此利用體外細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行神經(jīng)保護(hù)與損傷修復(fù)藥物研究已越來越受到廣泛關(guān)注。毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的三種基本細(xì)胞，三者關(guān)系非常密切，相互作用，相互影響。如不同的影響因子，其作用的靶細(xì)胞也不盡相同，有的可通過作用于神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)揮作用，有的作用于毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞或星形膠質(zhì)細(xì)胞，有的在生理?xiàng)l件下則可能無法通過血腦屏障和血脊屏障。然而，目前該類研究相關(guān)的體外細(xì)胞培養(yǎng)方式主要為兩大類：一類是對某一細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)，如單獨(dú)培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞，這種方法雖然避免了體內(nèi)環(huán)境中大量不可控因素，但是過于簡單的培養(yǎng)環(huán)境，往往導(dǎo)致所培養(yǎng)細(xì)胞喪失其體內(nèi)的部分生物學(xué)特性，忽略了中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元細(xì)胞周圍的其他兩種重要細(xì)胞（毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞），無法滿足關(guān)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)與損傷修復(fù)藥物研究的全部需要。另一類為兩細(xì)胞共培養(yǎng)，如神經(jīng)元細(xì)胞與星形膠質(zhì)原代細(xì)胞混合共培養(yǎng)以及利用Transwell系統(tǒng)將星形膠質(zhì)細(xì)胞等與毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)，借以研究血腦屏障和血脊屏障。此種方法只側(cè)重研究了中樞神經(jīng)系統(tǒng)中星形膠質(zhì)細(xì)胞與毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞或神經(jīng)元細(xì)胞的相互作用，也忽略了毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元細(xì)胞三者相互作用的系統(tǒng)關(guān)系。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述技術(shù)問題，提供一種基于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial?cells,?E）、星形膠質(zhì)細(xì)胞（astrocytes,?A）及神經(jīng)元細(xì)胞（neuron,?N）三種基本細(xì)胞形成的中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物研究的原代同源三細(xì)胞四維模型及構(gòu)建方法。

本發(fā)明的技術(shù)解決方案是：一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物研究的原代同源三細(xì)胞四維模型，在24孔培養(yǎng)板中有神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物及神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)基，在神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)基中插有Transwell?Insert，所述Transwell?Insert的濾膜內(nèi)室面涂有膠原蛋白Ⅳ，在Transwell?Insert的內(nèi)室面有毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物，在Transwell?Insert的外室面有星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物，所述星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的突起通過Transwell?Insert的濾膜孔徑穿向毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物，所述神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)基的組分及體積百分比如下：98%?神經(jīng)元細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、1%?雙抗、1%?L-谷氨酰胺。

一種上述中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物研究的原代同源三細(xì)胞四維模型的構(gòu)建方法，其特征在于按如下步驟進(jìn)行：

a.?分別提取同一種屬同一部位的星形膠質(zhì)細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及神經(jīng)元細(xì)胞并分別進(jìn)行原代培養(yǎng)；?

b.?在Transwell?Insert濾膜內(nèi)室面涂膠原蛋白Ⅳ，備用；