[發明專利]體外慢病毒介導BMP-2基因誘導滑膜間充質干細胞向軟骨細胞分化的方法

無效

• 申請號: 201310065020.2
• 申請日: 2013-02-28
• 公開（公告）號: CN103146755A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發明（設計）人: 符培亮;張雷;丁喆如;吳海山;吳宇黎;叢銳軍;陳松
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第二軍醫大學
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N5/10
• 代理公司: 上海世貿專利代理有限責任公司 31128
• 代理人: 嚴新德

技術領域:

本發明涉及生物醫學領域，尤其涉及一種軟骨分化的方法，特別是一種體外慢病毒介導BMP-2基因誘導滑膜間充質干細胞向軟骨細胞分化的方法。

背景技術:

近些年來，使用滑膜間充質干細胞進行半月板軟骨修復是關節外科的熱點問題。經典的組織工程學方法是將體外增殖誘導干細胞形成種子細胞，種植種子細胞在生物支架上，將支架移回生物體并添加各種細胞因子進行修復。

既往許多研究者選擇骨髓間充質干細胞（bone?marrow-dervied?mesenchymal?stem?cells，BMSCs）作為種子細胞。但是當De?Barii發現了滑膜間充質干細胞（synovium-dervied?mesenchymal?stem?cells，SMSCs）后，其迅速取代了BMSCs。原因在于：盡管SMSCs在細胞形態、免疫表型、集落形成能力和分化潛能方面和BMSCs相似，但其具有更強的軟骨分化潛能；此外，生理上當半月板出現損傷時，滑膜作為SMSCs的儲存器，會移行定植到損傷處,和局部細胞一起，完成修復過程。所以選擇SMSCs，更符合生理過程，并有更專一的軟骨分化潛能。

目前為止，有個案報道研究者采用轉化生長因子3（TGF-β3）和骨形成蛋白2（BMP-2）作為介導SMSCs向軟骨分化的誘導因子。Sakaguchiii、Shirasawaiii和Horie?Miv等利用TGF-β3、BMP-2和地塞米松（Dex），成功誘導SMSCs向纖維軟骨分化。但這一過程中仍存在諸多問題：誘導所需的BMP-2濃度需要非常高（50～200g/L甚至更高)，且時間很長，這就導致SMSCs有向骨分化的可能。且體外反復應用細胞因子存在降解失活的可能，并大大增加培養費用。所以在本發明的實驗中，采用慢病毒介導兔BMP-2基因轉染SMSCs，并加入EGFP基因作為報告基因，從而為應用組織工程學方法進行軟骨修復提供新思路和新方法。

發明內容：

本發明的目的在于提供一種體外慢病毒介導BMP-2基因誘導滑膜間充質干細胞向軟骨細胞分化的方法，所述的這種體外慢病毒介導BMP-2基因誘導滑膜間充質干細胞向軟骨細胞分化的方法要解決現有技術中體外誘導滑膜間充質干細胞向軟骨分化的方法成功率低、而且時間和成本高的技術問題。

本發明提供了一種體外慢病毒介導BMP-2基因誘導滑膜間充質干細胞向軟骨細胞分化的方法，包括一個將滑膜間充質干細胞分離、培養的步驟，還包括一個構建重組質粒pFUGW-oBMP-2的步驟，一個制備轉染慢病毒的病毒液的步驟，一個將轉染慢病毒轉染滑膜間充質干細胞的步驟，在所述的構建重組質粒pFUGW-oBMP-2的步驟中，首先根據BMP-2基因設計引物，通過逆轉錄反應擴增BMP-2基因，將已經包含EGFP報告基因的pFUGW質粒和BMP-2基因重組，構建重組質粒pFUGW-oBMP-2，在所述的制備轉染慢病毒的病毒液的步驟中，利用所述的重組質粒pFUGW-oBMP-2加上包裝質粒，共同構建轉染慢病毒，然后再加入緩沖液培養、孵育、移去上清、過濾后得到轉染慢病毒的病毒液，在所述的將轉染慢病毒轉染滑膜間充質干細胞的步驟中，取第三代以上的滑膜間充質干細胞和解凍的轉染慢病毒的病毒液混合，將混合物離心、培養40-52小時，然后將上述的培養物加入不完全成軟骨誘導培養液誘導培養液中誘導，誘導14天以上即可獲得軟骨細胞。

進一步的，在所述的制備轉染慢病毒的病毒液的步驟中，首先擴增重組質粒pFUGW-oBMP-2、包裝質粒psPAX2和pMD2.G，提純濃縮；其次將293T細胞的細胞密度調至10⁷，放入培養瓶中培養，所述的培養瓶內含有DMEM培養基，所述的培養基中還包含有青霉素G、鏈霉素、小牛血清、聚賴氨酸，所述的青霉素G在DMEM培養基中的濃度為100U/ml、所述的鏈霉素在DMEM培養基中的濃度為100μg/ml、所述的小牛血清在DMEM培養基中的質量百分比濃度為10%、所述的聚賴氨酸DMEM培養基中的濃度為5%，將293T細胞于培養瓶孵育后加入含有pFUGW-oBMP-2、psPAX2、pMD2.G的緩沖液，孵育、移去上清、過濾后得到轉染慢病毒的病毒液。

進一步的，在所述的構建重組質粒pFUGW-oBMP-2的步驟中，將oBMP-2的cDNA用Age1和Nhe1雙酶切，同時，將已經包含EGFP報告基因的pFUGW用Age1和Nhe1雙酶切，然后加入T4DNA反應得到pFUGW-oBMP-2重組質粒。