[發明專利]重組質粒pFastdual-polh-da26-Asp、家蠶桿狀重組病毒及利用該病毒生產L-天冬酰胺酶Ⅱ的方法

有效

• 申請號: 201310064827.4
• 申請日: 2013-03-01
• 公開（公告）號: CN103421845A
• 公開（公告）日: 2013-12-04
• 發明（設計）人: 費建明;王文兵;占鵬飛;吳巖;施國方
• 申請（專利權）人: 湖州市農業科學研究院
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/66;C12N7/01;C12N9/82;C12R1/93
• 代理公司: 湖州金衛知識產權代理事務所(普通合伙) 33232
• 代理人: 趙衛康

1.重組質粒pFastdual-polh-da26-Asp，其特征在于它是通過以下方法制備的：

（1）以家蠶桿狀病毒DNA為模板，SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2所示序列分別為上下游引物，通過PCR擴增反應，制得擴增產物da26；以大腸桿菌JM109基因組DNA為模板，SEQ?ID?No.3和SEQ?ID?No.4所示序列為上下游引物，通過PCR擴增反應，制得擴增產物Asp；

（2）擴增產物da26及Asp瓊脂糖凝膠電泳，回收純化后用XbaⅠ做單酶切，然后將da26、asp酶切產物純化并連接，得到da26-Asp連接產物；

（3）以da26-Asp連接產物為模板，以SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.4分別為上游引物進行PCR擴增，得擴增產物da26-Asp；

（4）擴增產物da26-Asp與質粒pMD??18-T做連接，得到重組質粒pMD??18-T-da26-Asp；

（5）以BmNPV?DNA為模板，SEQ?ID?No.5和SEQ?ID?No.6為上下游引物，通過擴增BmNPV?多角體基因的讀碼框，擴增的片段用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，克隆至桿狀病毒的p-polh、p-10雙啟動子轉移載體pFastdual質粒的多角體啟動子p-polh下，得到重組質粒pFastdual-polh；

（6）測序正確的重組質粒pMD??18-T-da26-Asp?以SmaⅠ和SphⅠ雙酶切，克隆至重組質粒pFastdual-polh的p-p10啟動子下，得到重組質粒pFastdual-polh-da26-Asp；

各引物序列如下：

SEQ?ID?No.1：TCCCCCGGGATGAATTCTGTTCACACG；

SEQ?ID?No.2：GCTCTAGAGCAATAGGCGTTAATATCACTTTG；

SEQ?ID?No.3：GCTCTAGAGCCCATCACCATCACCATCAC；

SEQ?ID?No.4：ACATGCATGCTTAGTACTGATTGAAGATCTGCT；

SEQ?ID?No.5：GCGGATCC?ATGCCGAATT?ATTCATACA；

SEQ?ID?No.6：ACATGAATTC?TTAATACGCCGGACCAGT。

2.利用權利要求1所述重組質粒制備的家蠶桿狀重組病毒，其特征在于它是通過以下方法制備的：

將所述重組質粒pFastdual-polh-da26-Asp在含BmNPV基因組的大腸桿菌Bm?DH10Bac中轉化,并在含有抗生素的培養板上培養，通過藍白斑篩選獲得陽性菌斑，隨后從陽性菌斑從抽提質粒DNA，該質粒DNA即為重組病毒的基因組；將此質粒DNA轉染家蠶細胞，分離培養基上清液，獲得含有da26與Asp融合表達的重組病毒。

3.利用權利要求2所述病毒生產L-天冬酰胺酶Ⅱ的方法，其特征在于:?用所述病毒感染家蠶，120小時后在該家蠶的BmN細胞中，分離得到緊密吸附在多角體蛋白顆粒表面的L-天冬酰胺酶Ⅱ，然后通過純化所述多角體蛋白來純化所述L-天冬酰胺酶Ⅱ，再通過洗脫，將L-天冬酰胺酶Ⅱ洗脫下來，制得純凈的L-天冬酰胺酶Ⅱ。