[發(fā)明專利]一種從冬蟲夏草菌絲體中提取蟲草多糖和腺苷的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310064402.3
• 申請日: 2013-02-28
• 公開（公告）號: CN103113442A
• 公開（公告）日: 2013-05-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李志剛;楊博;王永華;劉元元;唐家毅
• 申請（專利權(quán)）人: 華南理工大學(xué)
• 主分類號: C07H19/167
• 分類號: C07H19/167;C07H1/08;C08B37/00
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 宮愛鵬

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及到微生物菌絲體的分離技術(shù)，特別涉及到從微生物菌絲體中分離蟲草多糖與腺苷的方法。

背景技術(shù)

冬蟲夏草（Cordyceps?inensis）為傳統(tǒng)中醫(yī)藥的珍品，具有抗腫瘤、抗病毒、止血化痰、潤肺補(bǔ)腎等功效，與人參、鹿茸并稱為中藥三大補(bǔ)品。目前，蟲草菌絲體主要通過天然采摘和經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得兩條途徑獲得，其中經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的菌絲體，由于其主要成分、藥理作用及臨床效果上與天然冬蟲夏草基本相似，因此受到了廣泛的重視。目前蟲草菌絲體中的藥物活性成分主要包含多糖，腺苷與蟲草酸等。其中，蟲草多糖具有提高免疫功能、抗放療和抗腫瘤的作用；腺苷具有神經(jīng)保護(hù)、減慢心率、抗驚厥、抗輻射等功能，因此分離純化蟲草的多種藥理成分一直是研究的熱點(diǎn)之一。

目前從蟲草菌絲體中分離純化藥物活性成分，多采用高速離心、膜過濾、萃取、醇沉、柱層析、離子交換樹脂或分子篩吸附和減壓蒸餾等多步方法將某種藥理成分分離。Rongmin?Yu等用醇沉、Sevag法除蛋白、醇洗以及硅膠柱層析的方法純化蟲草多糖（Fitoterapia，2004，75(7-8):662–666），但最終僅得到多糖產(chǎn)品，并且收率較低。Jian?Ya?Ling等研究了超臨界萃取法（Separation?and?Purification?Technology,2009,66(3):625–629）自菌絲體中分離腺苷，但回收率僅為6.56%，并且需要40MPa的高壓，不但能耗巨大，而且容易破壞其他活性成分。現(xiàn)有針對蟲草菌絲體中有效成分的分離多需要幾步甚至十幾步的分離工藝，工藝復(fù)雜，操作條件不易控制，并且不能同時兼顧多種有效成分的分離，導(dǎo)致整個分離過程存在收率低、成本高等問題，因此急需新的工藝以提高其分離效率。

雙水相萃取技術(shù)始于20世紀(jì)60年代,雙水相現(xiàn)象是當(dāng)兩種聚合物或一種聚合物與一種鹽溶于水中并達(dá)到一定濃度時,由于聚合物之間或聚合物與鹽之間的分子空間阻礙作用,無法相互滲透,從而形成不互溶的兩相,稱為雙水相。由于該方法具有條件溫和,容易放大,可連續(xù)操作等優(yōu)點(diǎn),因此在蛋白質(zhì)、核酸和病毒等生物產(chǎn)品的分離和純化中，受到了廣泛的重視，但由于水溶性高聚物大多黏度大,難揮發(fā)，使工業(yè)化應(yīng)用受到限制。事實(shí)上，在適當(dāng)條件下,如果親水性有機(jī)溶劑，例如甲醇、乙醇、丙酮等，與水和無機(jī)鹽在適當(dāng)濃度下混合時，會出現(xiàn)液液分相現(xiàn)象，從而形成一種新型的雙水相萃取體系。其分相更清晰,成本更低,萃取相可通過精餾或蒸餾的方式加以回收。盡管這方面研究在國內(nèi)外剛剛起步,但已表現(xiàn)出良好的分離性能,如蛋白、金屬離子以及生物小分子上均得到相當(dāng)滿意的結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對目前從蟲草菌絲體存在的分離工藝復(fù)雜，分離能力小，總體收率低，成本高等問題，提供了一種采用雙水相萃取的方法從蟲草菌絲體中分離多糖和腺苷的方法。

本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種從冬蟲夏草菌絲體中提取蟲草多糖和腺苷的方法，包含以下步驟：

（1）將蟲草菌絲體或其提取液加水配置成菌絲體的混合液，其中菌絲體的含量范圍為1-700g/L；

（2）在步驟（1）的菌絲體混合液中加入10-700g/L可溶性無機(jī)鹽，以及10-600g/L醇類或酮類親水性有機(jī)物，得到的多相混合液靜置分相，上相為富含腺苷的溶劑相，下相為富含多糖的富鹽相；

（3）從上相中分離得到腺苷，從下相中分離得到蟲草多糖。

優(yōu)選地，所述親水性有機(jī)物為甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇、乙二醇和丙酮中的一種或多種。

優(yōu)選地，所述親水性有機(jī)物選擇甲醇時，菌絲體混合液中添加的可溶性無機(jī)鹽的陰離子為三價。

優(yōu)選地，所述陰離子為三價的無機(jī)鹽為磷酸氫二鉀/鈉、磷酸鉀/鈉或其混合物。

優(yōu)選地，所述可溶性無機(jī)鹽為氯化鈉、硫酸銨、碳酸鉀、碳酸鈉、硫酸鈉、磷酸氫二鉀、磷酸鉀、磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀中的一種或多種。

優(yōu)選地，所述可溶性無機(jī)鹽為固體或鹽溶液，加鹽后菌絲體溶液中鹽的飽和度達(dá)到10%～100%。

優(yōu)選地，步驟（3）中分離腺苷是采用蒸餾或精餾法從溶劑相中萃取以回收溶劑，得到腺苷粗品；分離蟲草多糖是采用超濾或透析將多糖和其他小分子分離，濃縮或經(jīng)吸附得到多糖粗品。萃取操作方式可以是間歇的，也可以是連續(xù)的；對于分配系數(shù)較小的體系可以采用多級萃取的方式。如果菌絲體未經(jīng)過濾或離心直接進(jìn)行萃取操作，這時往往在上下相之間形成一個富含菌體的固相層，有時也在下相底部形成固相層，這個系統(tǒng)可被稱為多相系統(tǒng)。萃取操作一般在低于溶劑易揮發(fā)的溫度下進(jìn)行。