[發(fā)明專利]eIF3a突變基因及其檢測引物、試劑盒、檢測方法、pcβa-eIF3a-Arg438Cys突變型質(zhì)粒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310063810.7
• 申請日: 2013-02-28
• 公開（公告）號: CN103224937A
• 公開（公告）日: 2013-07-31
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉昭前;王瑛;郭成賢;尹繼業(yè);陳娟
• 申請（專利權(quán)）人: 中南大學(xué)
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/10;C12N15/79;C12N15/66
• 代理公司: 長沙正奇專利事務(wù)所有限責(zé)任公司 43113
• 代理人: 盧宏

1.一種eIF3突變基因，其特征在于，所述基因序列如SEQ?ID?NO.1所示。

2.一種擴(kuò)增權(quán)利要求1所述突變基因的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括如下引物：

前引物：5’-CTGTACCATGATATTGCCCAGCAAG-3’；

后引物：5’-TCTTTACGCTGCCTTTTCCGT-3’。

3.一種擴(kuò)增權(quán)利要求1所述突變基因的方法，其特征在于，所述方法為：

從質(zhì)粒pcβa-eIF3a的全長cDNA上擴(kuò)增出突變基因并測序，pcβa-eIF3a基因序列如SEQ?ID?NO.7所示；擴(kuò)增體系為：5×Primer?star?Buffer20μL，dNTP?mix8μL，前引物2μL，后引物2μL，cDNA2μL，Primer?STAR1μL，加ddH₂O65μL至終體積100μL；擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5min，98℃10s，58℃退火15s，72℃2min共30個循環(huán)，72℃總延伸10min；所述前引物和后引物分別為權(quán)利要求2中所述的前引物和后引物。

4.一種pcβa-eIF3a-Arg438Cys突變型質(zhì)粒，其特征在于，所述質(zhì)粒包括權(quán)利要求1所述的突變基因，所述質(zhì)粒的核酸序列如SEQ?ID?NO.4所示。

5.一種制備權(quán)利要求4所述pcβa-eIF3a-Arg438Cys突變型質(zhì)粒的方法，包括如下步驟：

（1）從質(zhì)粒pcβa-eIF3a的全長cDNA上擴(kuò)增出含1458C>T位點的DNA片段Arg438Cys；擴(kuò)增引物為：

前引物：5’-CTGTACCATGATATTGCCCAGCAAG-3’；

后引物：5’-TCTTTACGCTGCCTTTTCCGT-3’；

擴(kuò)增體系為：5×Primer?star?Buffer20μL，dNTP?mix8μL，前引物2μL，后引物2μL，cDNA2μL，Primer?STAR1μL，加ddH₂O65μL至終體積100μL；擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5min，98℃10s，58℃退火15s，72℃2min共30個循環(huán)，72℃總延伸10min；

（2）將步驟（1）的擴(kuò)增的Arg438Cys用乙醇沉淀，然后在Arg438Cys末端加A尾；

（3）采用切膠法回收經(jīng)步驟（2）處理的Arg438Cys；

（4）將Arg438Cys與pGEM-T?easy載體連接后轉(zhuǎn)化至BL21高效率感受態(tài)細(xì)胞，于LB/氨芐平板上37℃過夜培養(yǎng)，再挑單克隆培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，然后用ApaI酶切驗證連接質(zhì)粒；

（5）定點誘變構(gòu)建pGEM-T?easy-Arg438Cys突變型載體：

PCR擴(kuò)增體系：10^*reaction?buffer5μL，-T?easy-Arg438Cys1μg，前引物5’-AACAACACCATCCTCTGCCTTCTGCAGCAGG-3’1.4μL，后引物5’-CCTGCTGCAGAAGGCAGAGGATGGTGTTGTT-3’1.3μL，dNTP?mix1μL，QuikSolution?reagent1.5μL，ddH2O加至50μL，最后加1μL?Quik?change?Enzyme；

熱循環(huán)：95℃2min，95℃20s，60℃10s，68℃2.5min共18個循環(huán)，最后68℃延伸5min；

將PCR產(chǎn)物經(jīng)DpnⅠ消化后轉(zhuǎn)化至XL10-Gold超級感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB/氨芐平板，37℃下培養(yǎng)后挑單克隆培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，即為pGEM-T?easy-Arg438Cys突變型載體；

（6）分別將pGEM-T?easy-Arg438Cys突變型載體和pcβa-eIF3a進(jìn)行MluI和BspDI雙酶切，將pcβa-eIF3a雙酶切后不含1458C>T位點的DNA片段與pGEM-T?easy-Arg438Cys酶切后含1458C>T位點的DNA片段進(jìn)行連接，然后將連接產(chǎn)物用DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，涂LB/氨芐平板篩選，挑單克隆LB培養(yǎng)基培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，即得pcβa-eIF3a-Arg438Cys突變型質(zhì)粒。