[發明專利]基因工程菌株恰塔努加鏈霉菌L11的構建及培養方法

無效

• 申請號: 201310063650.6
• 申請日: 2013-02-28
• 公開（公告）號: CN103131662A
• 公開（公告）日: 2013-06-05
• 發明（設計）人: 李永泉;王月月;江輝
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P19/62;C12R1/465
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 張法高;趙杭麗

技術領域

本發明涉及微生物技術領域，涉及微生物制藥領域中的基因工程菌株恰塔努加鏈霉菌L11及其培養方法。

背景技術

納他霉素是一種多烯大環內酯類抗真菌抗生素，由于其高效、廣譜、安全等優點被廣泛用于食品防腐劑和藥物。它能有效抑制大多數酵母和霉菌的生長，阻止真菌毒素的形成；由于其難溶于水和油脂，它很難被動物或人體的腸胃吸收，因而對哺乳動物細胞的毒性極低。

作為食品防腐劑，納他霉素具有低劑量、高效率、抗菌時間長、不影響食品的口味等優點。美國FDA（Food?and?Frug?Administrition）已經批準納他霉素用作食品防腐劑，并建議納他霉素作為食品添加劑使用，還被歸類為GRAS產品之列。1997年，我國食品添加劑委員會對納他霉素進行評價并建議批準使用，現已列入食品添加劑使用標準，其商品名稱為霉克（Natamycin^TM）。納他霉素還作為高效抗菌劑應用于滴眼液或軟膏等藥物中，用來治療真菌性角膜炎、腳蘚等真菌性皮膚感染疾病。目前已有30多個國家批準使用它作為天然生物性食品防腐劑和抗菌添加劑。國際上多采用褐黃孢鏈霉菌（Streptomyces?gilvosporeus）發酵生長納他霉素。

本發明人篩選得到了一株納他霉素生產菌株恰塔努加鏈霉菌L10，利用該菌株生產納他霉素的方法已經獲得中國發明專利（ZL200810162820.5）。該菌株納他霉素的遺傳性狀和發酵單位穩定，培養和發酵條件適合于工業化生產，但是該菌株的發酵單位較低，在工業發酵培養基中納他霉素發酵單位為2.21?g/L；而且發酵周期較長，納他霉素產量在培養144小時才達到最大值。

發明內容

本發明的目的是提供一株基因工程菌株恰塔努加鏈霉菌株，本發明提供的鏈霉菌屬為恰塔努加鏈霉菌（Streptomyces?chattanoogensis）L11，所述恰塔鏈霉菌命名為：?Streptomyces?chattanoogensis?L11，與原始菌株恰塔努加鏈霉菌L10相比，納他霉素產量提高了40%，而且發酵周期縮短了24小時。該菌保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC），保藏日：2013年1月21日，保藏登記號：CGMCC?No.?7182。所述恰塔努加鏈霉菌的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.?1所示，該DNA序列就命名為合成酶基因1。

本發明的另一個目的是提供所述的恰塔努加鏈霉菌的培養方法，通過以下步驟實現：

（1）固體培養：把恰塔努加鏈霉菌L11（CGMCC?No.?7182）的菌株接種于固體培養基中，于28℃培養箱中培養10天，收集孢子；

（2）液體培養：固體培養后，將孢子接種于種子培養基中，在30℃搖床上培養24h，200rpm，接種至發酵培養中，接種量5%（V/V），培養168h，即得。

步驟（1）所述的固體培養基為：酵母提取物為0.4%，麥芽提取物1%，葡萄糖0.4%，碳酸鈣?0.2%，瓊脂糖2%，其余為水，pH調至7.2，所述百分含量均為質量百分含量。

步驟（2）所述的種子培養基為：葡萄糖1.75%，蛋白胨1.5%，NaCl?1.0%，其余為水，所述百分含量均為質量百分含量。?

步驟（2）所述的發酵培養基為：生黃豆餅粉2.8%，酵母粉0.7%，葡萄糖6%，其余為水，所述百分含量均為質量百分含量。?

本發明的再一個目的是提供該菌株在產生納他霉素中的應用。

本發明通過生物信息學和體外生化反應鑒定出恰塔努加鏈霉菌L10中納他霉素生物合成途徑中的限速步驟和限速酶，通過基因工程技術提高某些限速酶基因的表達量獲得了一系列突變株，從突變株中篩選出納他霉素的發酵單位提高而且發酵周期縮短的基因工程菌株恰塔努加鏈霉菌L11。

該菌株在斜面培養基上培養后收集孢子，經種子培養基和發酵培養基進行發酵實驗驗證，通過高效液相色譜和紫外可見分光光度計測定菌絲和發酵液中納他霉素的產量，并與原始菌株L10進行比較。結果顯示L11的遺傳性狀穩定，納他霉素發酵單位從2.21?g/L提高到3.12?g/L，而且納他霉素發酵周期從144小時縮短為120小時。

本發明通過基因改造納他霉素生物合成途徑中的限速酶以提高納他霉素的產量，而且縮短發酵周期以降低工業化生產過程的成本。

附圖說明

圖1是恰塔努加鏈霉菌L11和恰塔努加鏈霉菌L10在發酵過程中納他霉素產量。