[發明專利]一種酶法不對稱還原制備(S)-4-氯-3羥基丁酸乙酯的方法

無效

• 申請號: 201310062928.8
• 申請日: 2013-02-28
• 公開（公告）號: CN103290072A
• 公開（公告）日: 2013-09-11
• 發明（設計）人: 嚴明;郝寧;沙風;魏淼
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12P7/62
• 分類號: C12P7/62;C12R1/645;C12R1/19
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務所 32237
• 代理人: 龔擁軍

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種羰酰還原酶在不對稱還原羰基化合物中的應用，尤其涉及一種羰酰還原酶(Carbonyl?Reductase?CR)在以4-氯乙酰乙酸乙酯（COBE）為前手性底物不對稱合成(S)-4-氯-3羥基丁酸乙酯中的應用。?

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背景技術

手性醇(Chiral?Alcohols)在手性藥物、農用化學品以及多種類型的手性材料制備中有廣泛應用。手性醇可由前手性烯烴的不對稱硼氫化–氧化、前手性羰基化合物的不對稱催化氫化、不對稱還原前手性羰基化合物等多種途徑制備。?

以(S)-4-氯-3羥基丁酸乙酯[(S)-CHBE]為例，?(S)-CHBE可用于很多活性藥物的合成，它是對映體選擇性合成Slagenins?B和C以及他汀類藥物——羥甲基戊二酰CoA(HMG-CoA)?還原酶抑制劑的關鍵手性中間體，而且(S)-CHBE還可以轉化生成1,4-二氫吡啶類β-阻滯劑^[1]。?

迄今為止，(S)-CHBE已經通過手性釕或銠等金屬催化的不對稱還原和生物催化法合成。利用化學轉化的方式適合工業大規模生產，但是其缺點是催化劑價格昂貴，反應條件苛刻，催化過程需要很高的氫氣壓力，對設備要求高，產物的光學純度不理想，達不到手性藥物中間體的制備要求。?

與化學法相比，生物催化法往往具有高效率、高立體選擇性、反應條件溫和以及經濟和社會效益好等優點。尤其是采用羰酰還原酶生物催化法不對稱還原COBE制備(S)-CHBE?受到普遍關注^[2]。?

目前已報道了細菌、酵母和霉菌等多種微生物能夠催化底物COBE為手性的CHBE，但野生的菌株往往顯示出較低的對映體過量值(enantiomeric?excess,?e.e.)值。解決上述問題的方法之一是篩選到優良的菌種，京都大學^[3]和江南大學分別篩選到了木蘭假絲酵母(Candida?magnoliae)和出芽短埂霉(Aureobasidium?pullulans)CGMCC1244，所制備(S)-CHBE的e.e.值均在97%以上。另一種切實可行的方法是將一個還原酶克隆到一個不能催化底物COBE的宿主中。Kizaki等從木蘭假絲酵母中克隆了羰酰還原酶S1，在大腸桿菌中進行表達后，對底物COBE有極高的活性及立體選擇性，在添加適量的NADP⁺后，產物(S)-CHBE在有機相中的濃度可達2.58?M，光學活性為100%，輔酶循環的轉化數為21600^[4]。由于催化COBE為(S)-CHBE的酶都屬于氧化還原酶，使用氧化還原酶進行生物催化時，合成產物的同時會消耗一定量的輔酶。而這些輔酶往往價格昂貴、穩定性低、從技術經濟角度考慮，投加大量輔酶是不可行的。因此，Shimizu等通過克隆脫氫酶的方式，將葡萄糖脫氫酶在重組大腸桿菌中進行表達，避免了添加商業化購買的葡萄糖脫氫酶，并實現輔酶的原位再生^[5]。華東理工大學的許建和等從藍色鏈霉菌（Streptomyces?coelicolor）中獲得一條依賴于NADH?的羰酰還原酶?ScCR，在大腸桿菌中表達后，并添加適量的輔酶NAD⁺，輔底物異丙醇后，利用水-甲苯的兩相反應體系及底物耦合的輔酶循環系統產生了3.6?M?的(S)-CHBE，光學純度大于99%^[6]。上述提及的兩種輔酶循環系統在目前應用的過程中仍需要額外添加一定量的輔酶NAD(P)⁺/NAD(P)H，這在很大程度上提高了生產成本。南京工業大學安明東等從白色念珠菌（Candida?albicans）中獲得一條依賴于NADPH?的山梨糖還原酶SOU1，發掘了SOU1用于底物耦合的潛在輔底物山梨醇、甘露醇以及木糖醇，擴大了SOU1在底物耦合輔酶循環系統中的應用，并在未額外添加輔酶情況下，實現了?(S)-CHBE的不對稱合成^[7]。?

????綜上所述，現有生物催化COBE為(S)-CHBE的技術得到進一步的發展，但是為擴大工業化生產，現有技術仍存在羰酰還原酶對底物耐受性差、酶的重復利用率低、產物得率低、生產成本高等問題。?