[發明專利]一種抗體檢測試劑盒(OmpC-IgA)

無效

• 申請號: 201310062278.7
• 申請日: 2013-02-28
• 公開（公告）號: CN103091500A
• 公開（公告）日: 2013-05-08
• 發明（設計）人: 朱凡;唐太清;陳菲;霍如松
• 申請（專利權）人: 蘇州和銳醫藥科技有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/569;G01N33/535;G01N21/76
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技術領域

本發明涉及免疫分析檢測領域。具體而言，本發明涉及一種檢測抗大腸桿菌外膜孔道蛋白C?IgA抗體的免疫分析檢測試劑盒。

技術背景

大腸桿菌是人體腸道內的正常細菌之一，一般情況下不致病。但在某些特殊情況下，當機體對大腸桿菌的某種蛋白過激反應時，可發生腹痛、腹瀉等腸炎癥狀。研究表明，一種病因復雜的非特異性炎癥性腸病((Inflammatory?Bowel?Disease，IBD)與機體對大腸桿菌外膜孔道蛋白C的過激反應有關，大約有50％的IBD患者血清抗OmpC的IgA抗體比正常人高2倍以上，因此，通過檢測血清中抗OmpC的IgA可以輔助診斷IBD。

現有檢測OmpC抗原的雙抗夾心法酶聯免疫試劑盒，但沒有檢測OmpC抗體的酶聯免疫檢測試劑盒。

發明內容

本發明的目的在于提供一種方便、靈敏、準確的檢測OmpC抗體的免疫分析檢測試劑盒，具體來說是檢測人抗大腸桿菌OmpC-IgA抗體的免疫分析檢測試劑盒。

本發明提供了一種檢測OmpC-IgA抗體的免疫分析檢測試劑盒，該試劑盒包括：包被有OmpC的微孔板、酶標記抗人IgA抗體、陰性對照品、陽性對照品、顯色劑、洗滌液。其中包被微孔板的OmpC是用重組的蛋白或者從大腸桿菌純化所得的蛋白。所述的酶標記抗人IgA抗體采用化學方法偶聯得到，標記酶為辣根過氧化物酶，所述偶聯方法為戊二醛法。

用于制備所述酶標板的固相材料，包括但不限于，例如，聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯。載體的形式是微量反應板凹孔。

所述的洗滌液為0.05％-0.5％吐溫-20的磷酸鹽緩沖液。所述的顯色劑由顯色劑A液和顯色劑B液組成(例如，體積比為1∶1)，顯色劑A液為過氧化氫或過氧化脲，顯色劑B液為鄰苯二胺或四甲基聯苯胺。所述的樣品稀釋液為含0.1％吐溫-20的磷酸鹽或碳酸鹽緩沖液，所述的抗體稀釋也為含0.1％吐溫-20的磷酸鹽或碳酸鹽緩沖液。

本發明的另一方面，提供了一種檢測血清中抗OmpC-IgA含量的方法，包括步驟：

(1)用權利要求1-8任一所述的試劑盒進行檢測，向OmpC包被的酶標板孔中加入對照品或待測樣品溶液，再加入酶標記的抗人IgA抗體，孵育后洗滌拍干，加入顯色劑、終止液，用酶標儀或化學發光儀測定吸光度值；

(2)分析檢測結果。

本發明試劑盒的檢測原理為：

將OmpC包被在固相載體上，加入待檢測樣品或對照品，樣品或對照品中的抗OmpC抗體就跟固相載體上的OmpC蛋白結合，形成抗原-抗體復合物，用洗滌液去除無關的成分，然后加入酶標記的抗人IgA抗體，酶標抗體與微孔板上的抗原-抗體結合，形成抗原-抗體-酶標抗體復合物，通過洗滌出去未結合的酶標記物，顯色后終止，測定樣品的吸光度值，該值與樣品中含抗OmpC-IgA抗體的量呈正相關，與陰性對照品和陽性對照品檢測所得的值進行比較即可得出樣品中是否含有抗OmpC-IgA抗體，以及抗體的含量多少。

具體實施方式

提供下述實施例是為了更好地理解本發明，而不是對本發明的內容和保護范圍構成任何限制。

實施例1大腸桿菌OmpC制備

試劑及儀器

1)試劑

大腸桿菌宿主菌DH5α、BL21(DE3)，克隆載體pCR2.1T-vector，表達質粒pET28a(+)，DNA聚合酶rTaq，T4DNA連接酶，DNA聚合酶rTaq、LATaq以及限制性內切酶BamH?I、Hind?III和EcoR?I、BamH?I，DL2000DNA?Marker、T4DNA連接酶，低分子量標準蛋白，DNA膠回收試劑盒，IPTG等

2)儀器

普通搖床SCS-24；隔水式恒溫電熱培養箱；Biophotometer分光光度計、臺式冷凍離心機Centrifuge?5810R、臺式離心機MiniSpin；高速冷凍離心機；蛋白質電泳儀以及凝膠成像系統；PCR儀；超聲裂解儀；恒溫金屬浴；HIS蛋白純化柱等。

3)實驗方法

載體構建

設計引物ATTG?GATC?CGCT?CCGAAAGA和TCTC?GAGT?TAAG?CCTG?CGGCT從模板DNA中PCR擴增出OmpC片段，膠回收試劑盒回收片段后連接到pCR2.1克隆載體進行測序鑒定。將鑒定正確的序列克隆至表達載體pET28a(+)中，酶切位點為EcoR?I、BamH?I，同時載體上有6×HIS標簽，便于后續的蛋白純化。

表達