[發明專利]一種灰星鯊軟骨血管生成抑制因子的制備方法及應用

有效

• 申請號: 201310061683.7
• 申請日: 2013-02-28
• 公開（公告）號: CN103232537A
• 公開（公告）日: 2013-08-07
• 發明（設計）人: 王斌;羅紅宇;栗麗;王玉梅
• 申請（專利權）人: 浙江海洋學院
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C07K1/18;C07K1/16;A61K38/17;A61P9/00;A61P35/00
• 代理公司: 杭州浙科專利事務所(普通合伙) 33213
• 代理人: 吳秉中

技術領域

本發明涉及一種灰星鯊軟骨血管生成抑制因子的制備方法及其N-末端氨基酸序列，本發明還涉及灰星鯊軟骨血管生成抑制因子在制備抑制血管生成、防治腫瘤藥物中的應用。?

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背景技術

血管生成在人體發育和組織修復等正常生理過程中發揮重要作用，同時也是腫瘤、糖尿病性視網膜病、風濕性關節炎和慢性炎癥等血管增生性疾病的重要病理特征之一。?

1970年，Folkman認為腫瘤的生長依賴于新生血管的生成，而通過抑制腫瘤的血管生成可達到治療腫瘤的目的。目前，已有的研究證明當腫瘤的體積達到2~3?mm²以上時就必須依賴新生血管為其繼續增殖提供必需的氧氣和營養物質，而此時抑制腫瘤的血管生成，就會切斷腫瘤的營養供給，導致腫瘤的退化、萎縮。因此，以抗血管生成為主的腫瘤生物治療研究成為近十多年來抗腫瘤藥物的研究熱點。?

與常規抗腫瘤藥物相比，腫瘤血管生成抑制劑具有許多優勢：處于增生狀態的血管有相對較高的靶分子表達，故腫瘤血管生成抑制劑治療腫瘤具有良好的特異性。實體瘤生長和轉移均須依賴血管生成，因而抗血管治療具有廣譜性。血管內皮細胞暴露于血流中，藥物可直接發揮作用，故劑量小、療效高、副作用相對較輕。內皮細胞基因表達相對穩定，不易產生耐藥性。因此，抗血管生成的腫瘤治療策略在未來的腫瘤治療中將發揮重要的作用。?

申請人研究發現，以灰星鯊軟骨為原料，制備血管生成抑制因子的研究處于空白階段，而灰星鯊軟骨血管生成抑制因子BSFN-I在制備抑制血管生成、防治腫瘤的藥物中的應用更是未見報道。?

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發明內容

本發明的目的在于提供一種灰星鯊軟骨血管生成抑制因子BSFN-I的N-末端氨基酸序列，具有這種N-末端氨基酸序列的灰星鯊軟骨血管生成抑制因子BSFN-I顯示強抑制血管生成活性。?

本發明的目的尚在于提供一種灰星鯊軟骨血管生成抑制因子BSFN-I的方法。?

本發明的目的還在于提供一種灰星鯊軟骨血管生成抑制因子BSFN-I的藥理性質，以利用于制備藥物。?

本發明為解決上述第一個技術問題所采取的技術方案為：一種灰星鯊軟骨血管生成抑制因子BSFN-I，其特征在于該血管生成抑制因子的N末端15個氨基酸殘基的排列順序為DPGTGDYKGADEFAK?SEQ?ID?NO:1，亦即Asp-Pro-Gly-Thr-Gly-Asp-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asp-Glu-Phe-Ala-Lys?SEQ?ID?NO:1，分子量為11.9?kDa，最適pH為7.0-8.5，穩定pH為5.0-9.0。?

本發明為解決上述第二個技術問題所采取的技術方案為：一種灰星鯊軟骨血管生成抑制因子BSFN-I的制備方法，其特征在于包括以下步驟：?

1）灰星鯊軟骨蛋白粗提液的提?。簩⒒倚酋徿浌瞧扑閯驖{，按固液比1?g：5~10?mL加入到濃度為1.0?mol/L鹽酸胍溶液中，于4?℃以下振蕩抽提24~36?h后，抽提溶液于4?℃以下、5?000?r/min離心10~15?min，去除殘渣，收集上清液；上清液繼續在4?℃下10?000?r/min離心15~20?min，取上清液；將上清液裝入截留分子量為8?kDa的透析袋中，利用Tris-HCl（pH?7.6）緩沖液于4℃以下透析18~24?h，每隔6?h更換Tris-HCl（pH?7.6）緩沖液1次，透析袋內溶液即為灰星鯊軟骨蛋白粗提液。

2）灰星鯊軟骨蛋白粗提液活性組分的制備：灰星鯊軟骨蛋白粗提液置于4?℃以下預冷0.5~1?h，緩慢加入4?℃以下預冷的丙酮至其濃度為30%，靜置0.5~1?h后，于4?℃以下10?000?r/min離心15~25?min，取離心上清液加入4?℃以下預冷的丙酮至丙酮濃度達60%，靜置0.5~1?h后，4?℃以下、9?000?r/min離心15~25?min，取沉淀置于截留分子量為8?kDa?的透析袋內用雙蒸水于4?℃以下透析18~24?h，每隔6?h更換雙蒸水1次，透析液冷凍干燥，得灰星鯊軟骨蛋白粗提液活性組分；?