[發(fā)明專利]一種基于受體傳感器檢測苦味物質(zhì)地那的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310060245.9
• 申請(qǐng)日: 2013-02-26
• 公開（公告）號(hào): CN103149110A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳春生;鄒玲;杜立萍;王平
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N5/02
• 分類號(hào): G01N5/02
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 周烽

1.一種基于受體傳感器檢測苦味物質(zhì)地那的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

（1）制備苦味受體蛋白T2R4；

（2）將苦味受體蛋白T2R4固定在石英晶體微天平傳感器表面制成受體傳感器；

（3）將不含任何苦味物質(zhì)的水溶液泵入密閉的檢測腔內(nèi)，待石英晶體微天平傳感器的諧振頻率達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定的狀態(tài)后，再將含有某一確定濃度的苦味物質(zhì)地那的溶液泵入檢測腔，待石英晶體微天平傳感器的諧振頻率再次穩(wěn)定后，諧振頻率的改變量即為此確定濃度的傳感器響應(yīng)值，最后再泵入不含任何苦味物質(zhì)的水溶液，清洗檢測腔，即完成一次檢測過程；至少間隔10min后，待石英晶體微天平傳感器的諧振頻率穩(wěn)定后，再泵入含有另一確定濃度的苦味物質(zhì)地那的溶液進(jìn)行下一次檢測；重復(fù)上述步驟，可以得到一系列苦味物質(zhì)地那的濃度對(duì)應(yīng)的傳感器諧振頻率改變量，得到地那濃度-諧振頻率改變量曲線；

（4）對(duì)于未知濃度的苦味物質(zhì)地那，首先將不含任何苦味物質(zhì)的水溶液泵入密閉的檢測腔內(nèi)，待石英晶體微天平傳感器的諧振頻率達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定的狀態(tài)F₀后，再將含有未知濃度的苦味物質(zhì)地那的待測溶液泵入檢測腔，待石英晶體微天平傳感器的諧振頻率穩(wěn)定到F₁后，得到諧振頻率改變量F₁-?F₀，最后根據(jù)上述步驟3得到的地那濃度-諧振頻率改變量曲線得到待測溶液中苦味物質(zhì)地那的濃度，實(shí)現(xiàn)液相中苦味物質(zhì)地那的濃度檢測。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述苦味物質(zhì)地那的檢測方法，其特征在于，所述步驟1包括以下子步驟：

（1.1）構(gòu)建表達(dá)載體：含有人苦味受體基因T2R4和rho-tag信號(hào)肽序列全長cDNA的質(zhì)粒pCEP4/rho-T2R4的基因序列如SEQ?ID?NO.1，構(gòu)建苦味受體基因22的表達(dá)載體過程如下：首先，設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，獲取和擴(kuò)增苦味受體基因序列全長cDNA，并對(duì)苦味受體基因進(jìn)行適當(dāng)?shù)男揎棧嫌我镄蛄腥鏢EQ?ID?NO.2所示，下游引物序列如SEQ?ID?NO.3所示，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)使用高保真聚合酶STAR在50?μL反應(yīng)體系中進(jìn)行，溫度循環(huán)首先是94℃預(yù)變性30秒，接著進(jìn)行29個(gè)循環(huán)的95℃?變性30秒、58℃退火30秒、72℃延伸60秒，最后是20℃降溫20秒；擴(kuò)增后的產(chǎn)物通過限制性內(nèi)切酶的雙酶切反應(yīng)亞克隆到表達(dá)載體pCEP4的多克隆位點(diǎn)Kpn?I和Not?I之間，完成苦味受體的表達(dá)載體pCEP4/rho-T2R4-his₆的構(gòu)建，并通過測序?qū)蛐蛄羞M(jìn)行鑒定得表達(dá)載體pCEP4/rho-T2R4-his₆的基因序列如SEQ?ID?NO.4所示；

（1.2）人胚胎腎細(xì)胞HEK-293的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：HEK-293細(xì)胞培養(yǎng)液為添加了體積百分比為10％的胎牛血清、青霉素（100?U/mL）和鏈霉素（100?μg/mL）的DMEM，培養(yǎng)條件為37℃、體積百分比為5%?CO₂的培養(yǎng)箱；轉(zhuǎn)染之前一天，HEK-293細(xì)胞被接種于六孔培養(yǎng)皿中，每孔接種0.5～2×10⁵?cells/mL濃度的細(xì)胞500?μL，在不含抗生素的培養(yǎng)液里生長至轉(zhuǎn)染前90-95%的融合度；轉(zhuǎn)染試劑為lipofectamin?2000，使用步驟1.1構(gòu)建好的表達(dá)載體pCEP4/rho-T2R4-his₆轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞；每孔使用4?μg表達(dá)質(zhì)粒，首先把表達(dá)質(zhì)粒用無血清培養(yǎng)液稀釋到50?μL，混勻；再用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋10?μL?的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑lipfectamin?2000至50?μL，在室溫下孵育5?min；接著把稀釋的表達(dá)質(zhì)粒和lipfectamin?2000混合，搖勻，室溫孵育20?min；把100?μL的混合液加到六孔板中每一個(gè)含有細(xì)胞和培養(yǎng)液的孔中，前后搖板混勻后，在37℃、體積百分比為5%?CO₂的培養(yǎng)箱孵育24?h；含有特異性抗融合表達(dá)的His₆-tag的苦味受體蛋白T2R4即可在細(xì)胞膜表面表達(dá)；

（1.3）苦味受體蛋白T2R4的提取：轉(zhuǎn)染后的HEK-293細(xì)胞用PBS清洗，并從六孔板收集；收集的細(xì)胞用超聲波探頭超聲5?min，然后16000?g?離心40?min；浮在表面的是細(xì)胞溶質(zhì)部分，小球是膜部分；浮在表面的部分用丙酮沉淀，沉淀物和尿素標(biāo)本緩沖液混合；小球用含有蛋白酶抑制劑雞尾酒的細(xì)胞裂解液在0℃冰凍條件下溶解30?min；然后，將尿素樣品緩沖液加入到溶解的小球溶液中，即可獲得粗提的膜蛋白，其中含有異源表達(dá)于細(xì)胞膜上的苦味受體蛋白T2R4；含有苦味受體蛋白T2R4的細(xì)胞膜組分用于構(gòu)建石英晶體微天平傳感器，細(xì)胞膜的疏水環(huán)境有利于保持苦味受體的結(jié)構(gòu)和功能。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述苦味物質(zhì)地那的檢測方法，其特征在于，所述步驟2具體為：本發(fā)明的受體傳感器制備過程如下：在干凈的石英晶體微天平傳感器的金電極表面通過金硫鍵共價(jià)固定一層可以特異性識(shí)別融合表達(dá)的His₆-tag標(biāo)簽的巰基化單鏈DNA適配體，該適配體的序列由HS-(CH₂)₆和SEQ?ID?NO.5所示的基因序列共價(jià)連接組成；反應(yīng)條件為室溫下反應(yīng)1?小時(shí)；用質(zhì)量百分比為1%的牛血清白蛋白封閉石英晶體微天平傳感器的金電極表面未反應(yīng)的位點(diǎn)，封閉條件為室溫下1?小時(shí)；把含有異源表達(dá)的苦味受體蛋白T2R4的細(xì)胞膜均勻涂覆在石英晶體微天平傳感器的金電極表面，并放在室溫孵育過夜，使苦味受體蛋白通過融合表達(dá)的His₆-tag與適配體發(fā)生特異性的結(jié)合，實(shí)現(xiàn)在石英晶體微天平傳感器的金電極表面特異性固定和純化苦味受體蛋白T2R4的目的；石英晶體微天平傳感器的金電極表面用PBS沖洗，除去未結(jié)合的多余物質(zhì)；完成用于苦味物質(zhì)地那檢測的受體傳感器的構(gòu)建。