[發(fā)明專利]一個(gè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA基因的應(yīng)用方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310059864.6
• 申請(qǐng)日: 2013-02-26
• 公開（公告）號(hào): CN103160580A
• 公開（公告）日: 2013-06-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 熊煒;李桂源;曾朝陽;李小玲;張文玲;范松青;石磊;李夏雨;向波;肖凱;向娟娟;彭淑平;周艷宏;肖嵐;李征;曹利
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 長(zhǎng)沙市融智專利事務(wù)所 43114
• 代理人: 袁靖

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于腫瘤分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一個(gè)新克隆的長(zhǎng)鏈非編碼RNA基因序列的應(yīng)用方法。

背景技術(shù)

原發(fā)性肝癌是亞洲與部分非洲地區(qū)的高發(fā)腫瘤，其病死率居我國(guó)惡性腫瘤的第二位，五年生存率只有5%左右，肝癌的防治及其發(fā)病機(jī)制研究一直是我國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中的重要課題。肝細(xì)胞癌(hepatocellular?carcinoma，HCC)是原發(fā)性肝癌的一種主要類型，盡管目前在肝細(xì)胞癌的診斷和治療方面有了新的進(jìn)展，但是對(duì)于其發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移的確切機(jī)制仍然存在大量未知的問題。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（longnon-coding?RNA，lncRNA）是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，研究發(fā)現(xiàn)很多l(xiāng)ncRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有重要調(diào)節(jié)作用，它具有抑制腫瘤生長(zhǎng)和促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移等生物學(xué)作用。lncRNA根據(jù)其基因位置可分為五種類型：正義lncRNA(sense?lncRNA)、反義lncRNA(antisense?lncRNA)、雙向lncRNA(bidirectional?lncRNA)、基因內(nèi)lncRNA(intronic?lncRNA)及基因間lncRNA(intergenic?lncRNA)。之前一直被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄“噪音”的lncRNA，因在基因調(diào)節(jié)中的重要功能，目前已成為繼miRNA之后非編碼RNA領(lǐng)域又一研究熱點(diǎn)。近年的研究已表明，lncRNA參與X染色體沉默、基因組印記以及染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核內(nèi)運(yùn)輸?shù)榷喾N重要的調(diào)控過程。lncRNA有望成為腫瘤診斷、治療和預(yù)后新的標(biāo)志物，同時(shí)也為腫瘤的治療提供了新的靶點(diǎn)。

新一代測(cè)序(Next?Generation?Sequencing，NGS)技術(shù)的迅猛發(fā)展將基因組水平的研究帶入了一個(gè)新的階段，許多基于全基因組的研究成為可能，RNA測(cè)序(RNA-Sequencing，RNA-Seq)就是利用新一代測(cè)序技術(shù)對(duì)生物樣品轉(zhuǎn)錄的全部RNA進(jìn)行高通量測(cè)序，以獲得被測(cè)樣品轉(zhuǎn)錄組(transcriptome)數(shù)據(jù)的一種重要新技術(shù)。

最近我們利用新一代測(cè)序技術(shù)對(duì)肝細(xì)胞癌患者活檢標(biāo)本及正常對(duì)照肝組織樣品進(jìn)行RNA-Seq，在肝癌樣品中檢測(cè)到染色體11q13.1區(qū)域存在相鄰的幾個(gè)明顯RNA-Seq信號(hào)峰，而在正常對(duì)照組織中卻沒有，且該染色體區(qū)域目前尚無已知基因登錄，提示可能存在一個(gè)或多個(gè)未知的新基因。我們以此為線索，證實(shí)這幾個(gè)RNA-Seq峰來自同一個(gè)新基因，并克隆了該基因全長(zhǎng)序列。該基因全長(zhǎng)序列為3526bp，可轉(zhuǎn)錄成多個(gè)轉(zhuǎn)錄本，將該基因全長(zhǎng)的序列輸入ORF?finder軟件進(jìn)行開放閱讀框預(yù)測(cè)，未發(fā)現(xiàn)明顯的開放閱讀框，說明該基因編碼一個(gè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long?non-coding?RNA，lncRNA)。

我們從肝癌及正常對(duì)照組織中抽提RNA后通過逆轉(zhuǎn)錄，實(shí)時(shí)定量PCR，檢測(cè)了該lncRNA的表達(dá)情況，結(jié)果顯示該lncRNA在肝癌組織中表達(dá)上調(diào)（P<0.001）。我們隨后又利用原位雜交的方法，進(jìn)一步在大樣本中驗(yàn)證了該lncRNA在肝癌中表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.001）。因此針對(duì)該lncRNA的檢測(cè)制劑可用于肝癌的輔助診斷。生存曲線分析發(fā)現(xiàn)該lncRNA表達(dá)高的患者其生存時(shí)間短于該lncRNA表達(dá)低的患者（P=0.024）。因此針對(duì)該lncRNA的檢測(cè)制劑也可以用于肝癌的預(yù)后判斷。

我們還針對(duì)該lncRNA基因的序列設(shè)計(jì)了用于RNA干擾的短發(fā)夾RNA表達(dá)載體，利用該載體在肝癌細(xì)胞系中抑制了該lncRNA的表達(dá)，且發(fā)現(xiàn)抑制該lncRNA表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞系的生長(zhǎng)。因此針對(duì)該lncRNA的抑制制劑也具有肝癌基因治療的潛在用途。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一個(gè)新克隆肝癌相關(guān)lncRNA基因的應(yīng)用方法，根據(jù)該基因序列，設(shè)計(jì)并合成實(shí)時(shí)定量PCR引物和原位雜交探針，制備用于肝癌輔助診斷或者療效預(yù)測(cè)的制劑。

一個(gè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA基因的應(yīng)用方法，根據(jù)該基因制備用于肝癌輔助診斷或者療效預(yù)測(cè)的制劑；該基因轉(zhuǎn)錄本序列為序列表中SEQ?ID?NO：1-12所示的核苷酸序列中的任一條；或者是與序列表中SEQ?ID?NO：1-12任一條所示的序列具有90%以上同源性的核苷酸序列；或者是與序列表中SEQ?ID?NO：1-12任一條所示的序列經(jīng)硫代修飾或/和甲氧基修飾得到的核苷酸序列。

用于肝癌輔助診斷或者療效預(yù)測(cè)的制劑包括原位雜交檢測(cè)試劑和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)試劑。

根據(jù)該基因設(shè)計(jì)并合成用于原位雜交的寡核苷酸探針。