[發明專利]一種同時測定轉Bt基因抗蟲棉種子發芽率、抗蟲性純度的方法

無效

• 申請號: 201310058825.4
• 申請日: 2013-02-25
• 公開（公告）號: CN103109622A
• 公開（公告）日: 2013-05-22
• 發明（設計）人: 王凱輝;郭寶生;耿軍義;劉素恩;趙存鵬;馬玉柱;耿香利;劉敏彥
• 申請（專利權）人: 河北省農林科學院棉花研究所
• 主分類號: A01C1/02
• 分類號: A01C1/02;A01G7/00
• 代理公司: 石家莊匯科專利商標事務所 13115
• 代理人: 張梅申

技術領域

本發明涉及轉基因植物檢測，涉及一種同時測定轉基因抗蟲棉種子發芽率、抗蟲性純度的方法，更具體的說是一種測定轉Bt基因抗蟲棉種子發芽率的同時，通過噴灑一定濃度的抗生素溶液檢測抗蟲性純度的方法。

背景技術

轉Bt基因抗蟲棉已在生產上被廣泛應用，并有效地控制了棉鈴蟲的危害。然而抗蟲棉的抗蟲性純度直接影響著棉花的產量和品質，因此在棉花生產和經營中進行棉花種子的抗蟲性檢測是必不可少的環節。

早在1998年中國農業大學的王保民等就已經開始利用雙抗夾心ELISA檢測方法對抗蟲棉Bt殺蟲晶體蛋白進行檢測研究，并取得了初步效果。王坤波等（2000年）在苗床對轉Bt基因抗蟲棉子葉用卡那霉素溶液涂抹或浸潤的方法進行了抗蟲性研究，馬麗華等（2000年）對轉Bt基因抗蟲棉子葉用卡那霉素溶液涂抹或浸潤的方法進行了田間抗蟲性研究，都取得了很好的效果。

目前對轉Bt基因抗蟲棉的抗蟲性純度的常用測定方法主要有卡那霉素抗性基因田間種植檢測法和試紙條法。卡那霉素抗性基因田間種植檢測法主要是采取葉片涂抹的方法，在大田播種出苗后，用硫酸卡那霉素溶液涂抹子葉或真葉來檢測種子的抗蟲性，這種田間種植檢測的方法需要在大田種植，對于棉花種子的經營者來說，通常需要延緩一個種植季節出售；而試紙條法則是通過檢測毒蛋白來檢測棉花中的抗蟲性，快速、簡便易行，但費用高，每百粒棉種僅試紙成本就得600-700元，因此該方法可作小范圍急用使用，大規模生產經營的棉種企業或種植戶不常使用。另外，檢測轉Bt基因抗蟲棉的抗蟲性純度的方法還有PCR檢測、Southern和Northern雜交、卡那霉素抗性室內基因鑒定、Gus基因檢測、EL?ISA快速定量檢測等，這些方法檢測時間短，但需專業技術人員來操作，是科研單位實驗室常用的方法。上述無論哪種檢測方法都只能檢測棉花種子的抗蟲性，而對于棉花種子生產和銷售者來說，在進行種子抗蟲性檢測的同時還往往需要另外再通過目測法、沙床培養法、毛巾培養法、恒溫箱培養法等進行種子的發芽率的檢測。

發明內容

為了避免上述現有檢測技術的缺陷，本發明在適宜抗生素選擇壓力下，利用轉Bt基因植株帶有的新霉素磷酸轉移酶(nptⅡ)基因作標記所編碼的產物可使卡那霉素等氨基糖苷類抗生素失活而能夠正常生長，而非轉Bt基因植株因不含有nptⅡ基因作標記而不能夠正常生長的機制，發明了一種同時測定轉Bt基因抗蟲棉種子發芽率、抗蟲性純度的方法。

本發明提供了一種同時測定轉Bt基因抗蟲棉種子發芽率、抗蟲性純度的方法，包括如下步驟：

1、配制0.4%-0.6%硫酸卡那霉素水溶液；

2、濕沙準備：選擇干凈河沙與水按6-8:1比例拌勻備用；

3、播種：將步驟2準備的濕沙均勻鋪到直徑50cm的塑料盆底部，厚度2-4cm；在濕沙上均勻擺放待檢測的棉花種子100粒，種子間距不小于1.5cm；然后再在種子上面覆上厚3-4cm步驟2準備的濕沙，壓實；塑料盆頂上蓋一層塑料薄膜；

4、培養：將步驟3中播好種子的塑料盆擺放在安裝日光燈的室內，光照時間12小時/天，室內溫度20℃-30℃；第3天揭掉塑料薄膜，在濕沙表面均勻噴灑300mL步驟1中制備的硫酸卡那霉素水溶液；第5天開始每隔2-3天給濕沙噴水，防止濕沙表面變干；第7天統計發芽率，第13-15天觀察抗蟲性。苗勢壯、葉色深綠的為抗蟲株；苗勢弱、子葉有黃斑或子葉全部變黃的為非抗蟲植株。

步驟1中配制的是0.4%的硫酸卡那霉素水溶液。

步驟2中選擇干凈河沙與水按7:1比例拌勻備用。

步驟3中將步驟2所述的濕沙均勻鋪到直徑50cm的塑料盆底部，厚度3cm；在濕沙上均勻擺放待檢測的棉花種子100粒，種子間距為1.5cm；然后再在種子上面再覆上厚3cm步驟2所述的濕沙，壓實；用一層塑料薄膜封住盆口。

步驟4中所述的室內溫度為26℃。

本發明的有益效果在于：1、操作簡單易行：設備簡單，一般人員都能操作；2、費用低，檢測100粒棉種所用試劑費用約為試紙條法的1.5%；3、本發明在檢測轉Bt基因棉花種子發芽率的同時可以檢測棉花種子的抗蟲性純度；4、本方法的檢測準確度達到100%。

下面結合具體實施例對本發明作進一步闡述，但不以任何方式限制本發明的范圍。

具體實施方式

實施例中所用硫酸卡那霉素粉劑（純度100%）購于上海生工生物工程技術服務有限公司，所用轉Bt基因抗蟲棉品種冀1316和非抗蟲棉品種冀棉25的種子均由本所提供。