[發(fā)明專利]一種無創(chuàng)檢測表皮生長因子受體T790M突變的酶切富集PCR法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310058245.5
• 申請(qǐng)日: 2013-02-25
• 公開（公告）號(hào): CN103131779A
• 公開（公告）日: 2013-06-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 何臣
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 深圳市千納專利代理有限公司 44218
• 代理人: 胡堅(jiān)

所屬技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體涉及的是無創(chuàng)檢測表皮生長因子受體T790M突變的酶切富集PCR法。?

背景技術(shù)

非小細(xì)胞肺癌（non?small?cell?lung?cancer，NSCLC）是一種常見的惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)發(fā)病率呈逐年升高趨勢，已成為我國乃至全世界范圍內(nèi)腫瘤相關(guān)性疾病死亡的主要原因之一。NSCLC對(duì)常規(guī)放化療均不敏感，以鉑類和紫杉類為代表的第二、三代化療藥物雖然已被證明療效較前有所提高，但相對(duì)于大部分晚期病人而言，總體生存獲益并不大。近年來，隨著對(duì)NSCLC細(xì)胞異常信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的不斷闡明，以吉非替尼為代表的表皮生長因子受體（epidermal?growth?factor?receptor，EGFR）酪氨酸激酶抑制劑在改善晚期NSCLC患者療效與生活質(zhì)量中的作用已經(jīng)得到國際多中心臨床研究的充分肯定。然而，吉非替尼治療的總體有效率僅為10%～30%，進(jìn)一步的分子遺傳學(xué)研究證實(shí)：吉非替尼對(duì)具有EGFR激酶區(qū)域特征性突變的NSCLC（外顯子19缺失及外顯子21L858R突變）患者療效顯著優(yōu)于EGFR基因?yàn)橐吧偷腘SCLC患者（存在EGFR基因外顯子19缺失及外顯子21L858R突變的患者接受吉非替尼治療后客觀緩解率提高到65%-94%）。遺憾的是，即便患者具有EGFR基因突變，隨著治療時(shí)間的延長最終均不可避免地產(chǎn)生吉非替尼獲得性耐藥而導(dǎo)致疾病進(jìn)展；且吉非替尼價(jià)格?十分昂貴，患者服用一個(gè)月需要10000元左右，此外非必要的吉非替尼治療還有可能產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用如：致死性間質(zhì)性肺炎。因此建立一種敏感特異、簡便易行的臨床診斷方法來準(zhǔn)確地預(yù)測吉非替尼治療NSCLC患者獲得性耐藥的發(fā)生成為臨床上亟盼解決的重要問題。?

NSCLC對(duì)吉非替尼獲得性耐藥的分子機(jī)制復(fù)雜，目前得到普遍認(rèn)同的是EGFR基因外顯子20的T790M突變和c-MET原癌基因擴(kuò)增，其中約50%以上的患者吉非替尼治療獲得性耐藥與腫瘤細(xì)胞EGFR基因T790M突變有關(guān)；而c-MET基因擴(kuò)增的鑒定需進(jìn)行熒光原位雜交，技術(shù)要求高，操作繁瑣，價(jià)格昂貴，對(duì)檢測標(biāo)本要求高。進(jìn)一步的研究亦證明：NSCLC患者治療前的EGFR基因T790M突變與患者接受吉非替尼治療后的療效呈顯著負(fù)相關(guān)，因此通過檢測EGFR基因T790M突變來準(zhǔn)確地預(yù)測吉非替尼治療NSCLC患者獲得性耐藥的發(fā)生是臨床實(shí)踐中切實(shí)可行的實(shí)驗(yàn)診斷方法。?

目前NSCLC患者EGFR基因T790M突變的檢測標(biāo)本多來自于支氣管纖維鏡、經(jīng)皮肺細(xì)針穿刺活檢標(biāo)本或胸腔積液診斷標(biāo)本，因而，EGFR基因T790M突變的檢測僅局限于能夠進(jìn)行經(jīng)支氣管纖維鏡、經(jīng)皮肺細(xì)針穿刺活檢或有胸腔積液的部分患者中，而且肺癌組織異質(zhì)性明顯，細(xì)針穿刺活檢的少量標(biāo)本能否代表整個(gè)腫瘤組織的遺傳學(xué)變異尚有待進(jìn)一步的研究確認(rèn)。因此，迫切需要通過采樣更為便捷、患者依從性好的方法來進(jìn)行EGFR基因T790M突變?cè)\斷。?

研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)：實(shí)體腫瘤在形成和發(fā)展過程中常常有少量癌細(xì)胞從原發(fā)腫瘤脫落進(jìn)入血液循環(huán)，導(dǎo)致腫瘤患者外周血游離核酸含量顯著高于健康人群，且外周血游離核酸與原發(fā)腫瘤的基因組DNA具有相同的遺傳變異。但外周血中的游離核酸可能僅有非常少量的突變基因，而含有大量的野生型基因，其中混?雜的大量野生型基因會(huì)阻礙突變基因的檢出，需要高度敏感特異的基因突變檢測技術(shù)。目前已報(bào)道應(yīng)用于EGFR基因T790M突變檢測的方法有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接測序法、Taqman探針、PCR-SSCP、擴(kuò)增阻滯突變檢測系統(tǒng)等，上述方法各有利弊，臨床未能開展EGFR突變檢測的主要原因在于難以做到采樣方法便捷，方法簡便靈敏特異以及無需特殊的儀器設(shè)備等諸方面同時(shí)兼顧。因此，如能有效富集外周血中游離的突變體核酸，就能夠解決NSCLC患者EGFR基因T790M突變檢測的臨床應(yīng)用瓶頸問題。?

突變體酶切富集PCR法通過采納野生型與突變體特異性限制性內(nèi)切酶，選擇性去除野生型序列片斷，擴(kuò)增突變序列，從而極大提高了檢出血中靶目標(biāo)腫瘤核酸的靈敏度，對(duì)靶基因突變的檢測極限可達(dá)到0.1％[15]；依據(jù)該原理，本發(fā)明根據(jù)EGFR基因T790M突變體及野生型序列堿基的差異，通過設(shè)計(jì)合適的PCR引物在PCR擴(kuò)增過程中導(dǎo)入特定的限制性內(nèi)切酶切位點(diǎn)，建立了EGFR基因T790M突變酶切富集PCR法。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的之一在于提供用于無創(chuàng)檢測EGFR基因T790M突變的酶切富集PCR法，為實(shí)現(xiàn)上述目的的，申請(qǐng)人采用技術(shù)方案如下：?

1、采取患者的外周血標(biāo)本，分離血漿/血清，提取游離核酸；?