[發明專利]一種新型狂犬病病毒假病毒系統及其制備與應用

無效

• 申請號: 201310058190.8
• 申請日: 2013-02-25
• 公開（公告）號: CN103173495A
• 公開（公告）日: 2013-06-26
• 發明（設計）人: 譚文杰;鄧瑤;呂新軍;唐青
• 申請（專利權）人: 中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N7/04;G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域：

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種新型狂犬病病毒假病毒系統及其制備與應用。

背景技術：

狂犬病是由狂犬病病毒(rabies?virus，RV)引起的一種人獸共患傳染病，一旦發病，病死率幾乎100％。發生狂犬病暴露時需要及時進行狂犬病暴露后處置，主要包括接種狂犬病疫苗和注射狂犬病免疫球蛋白制劑，使機體產生或獲得狂犬病病毒中和抗體，從而阻止病毒入侵機體。

國內人用狂犬病疫苗生產企業普遍應用的狂犬病病毒疫苗株為PV、CTN1、aG，然而國內對這些疫苗株抗原性和保護性的研究資料并不充分，原因在于狂犬病病毒野毒株的分離、培養需要在BSL-3級實驗室進行，并且國內分離的狂犬病病毒野毒株數量有限，限制了疫苗接種后野毒攻擊試驗的開展范圍。依據疫苗株和野毒株核酸和氨基酸序列相似性來推導抗原性相似是目前較通用的做法，然而，大量抗狂犬病病毒糖蛋白和核蛋白單克隆抗體結合試驗提示狂犬病病毒野毒株和疫苗株在抗原性方面存在差異，僅依靠序列相似性來推導抗原相似性的做法并不妥當。建立一種行之有效的模型在體外試驗水平評估人用狂犬病病毒疫苗株免疫對野毒株的保護效果有一定意義。

快速熒光灶抑制試驗(rapid?fluorescent?focus?inhibition?test，RFFIT)是世界衛生組織(World?Health?Organisation，WHO)推薦的狂犬病病毒中和抗體體外檢測方法之一，該方法是在細胞培養基礎上進行的微量中和試驗，一個流程可在24h內完成，在96孔板上進行適合大批量樣品檢測，通常用于評價疫苗接種后機體對狂犬病病毒的中和能力。考慮到攻擊病毒為野毒株時需要BSL-3級實驗室并且野毒株數量有限，如果可以采用狂犬病病毒野毒株的模擬病毒(即狂犬病病毒假病毒)作為攻擊病毒，那么一方面可以擴大驗證范圍，另一方面有可能降低實驗所要求生物安全級別。

發明內容：

假病毒包裝系統主要有：以鼠類白血病病毒(murine?leukemia?virus，MLV)為基礎構建的逆轉錄病毒載體和包裝組份；以慢病毒(lentivirus)，如HIV-1，為基礎構建的慢病毒載體和包裝組份。以慢病毒載體為基礎的假病毒不同于以逆轉錄病毒載體為基礎的假病毒，對分裂期和非分裂期細胞均具有感染能力。利用假病毒模擬病毒包膜糖蛋白活性使一些沒有敏感培養細胞系的病毒(如HCV)的中和抗體檢測成為可能，也使一些生物安全級別要求較高的病毒(如HIV)的中和抗體檢測可以在BSL-2級實驗室進行。關于制備狂犬病病毒假病毒進行狂犬病相關研究的報道非常有限和缺乏系統性。

為了克服目前狂犬病病毒研究的上述局限性，本發明利用逆轉錄病毒和慢病毒載體平臺構建狂犬病病毒假病毒，并在此基礎上摸索將狂犬病病毒假病毒應用于狂犬病病毒中和抗體評價、狂犬病病毒中和性單克隆抗體抗原表位篩選、抗狂犬病病毒藥物(進入或融合抑制劑)高通量篩選、新型狂犬病疫苗制備，形成一套全新的狂犬病病毒假病毒構建、制備及應用技術體系。

本發明的技術方案如下：

一種新型狂犬病病毒假病毒系統，包括含有狂犬病病毒糖蛋白基因的pVRC-RVG系列穿梭質粒與輔助質粒所共同構成的載體系統以及宿主細胞，將載體系統中的穿梭質粒和輔助質粒共同轉染宿主細胞后，即可在培養上清中獲得狂犬病病毒假病毒。

如上述技術方案所述狂犬病病毒假病毒系統，其中，所采用的pVRC-RVG系列穿梭質粒為分別含有狂犬病病毒標準攻擊毒株CVS-11、疫苗株PV、CTN1、aG的糖蛋白基因序列并能表達相應蛋白的質粒pVRC-CVSG、pVRC-PVG、pVRC-CTN1G、pVRC-aGG。

如上述技術方案所述狂犬病病毒假病毒系統，其中，優選采用慢病毒雙質粒系統，慢病毒三質粒系統、逆轉錄病毒三質粒系統亦可采用。

如上述技術方案所述狂犬病病毒假病毒系統，其中，其所述輔助質粒分別為慢病毒雙質粒系統的pNL4-3.GFP/Luc.R-E-，慢病毒三質粒系統的pCS-CG+pCMVΔR8.2以及逆轉錄病毒三質粒系統的pMLV-gagpol+pMLV-EGFP。

如上述技術方案所述狂犬病病毒假病毒系統，其中，所優選采用的宿主細胞為293FT細胞。

新型狂犬病病毒假病毒的制備方法，包括如下步驟：

a、采用pVRC載體構建含有狂犬病病毒標準攻擊毒株CVS-11、疫苗株PV、CTN1、aG糖蛋白基因的pVRC-RVG系列穿梭質粒pVRC-CVSG、pVRC-PVG、pVRC-CTN1G、pVRC-aGG；