[發(fā)明專利]一種制備胸腺肽α1的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310058144.8
• 申請(qǐng)日: 2013-02-25
• 公開（公告）號(hào): CN103088051A
• 公開（公告）日: 2013-05-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 伏顯華;劉亭見;岑峻宇
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京諾派生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/70
• 分類號(hào): C12N15/70;C07K14/575;C07K1/34;C12R1/19
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種制備胸腺肽α1的方法。

背景技術(shù)

1965年Goldestein等人從動(dòng)物胸腺中分離到有生物活性的多肽類分子，命名為胸腺肽(Thymosin)。1972年Goldestein等進(jìn)一步純化所得到的主要分子量在1-15KD的組分，稱之為胸腺肽組分5(Thymosin，TF5)，用于動(dòng)物研究和臨床觀察，發(fā)現(xiàn)該組分有補(bǔ)償胸腺功能低下作用。

胸腺肽α1(Thymosinα1,Tα1)是胸腺肽組分5(TF5)多肽混合物中活性最強(qiáng)的多肽之一，具有促進(jìn)T-淋巴細(xì)胞分化、成熟和增強(qiáng)細(xì)胞免疫的功能，目前國(guó)外已將其肽合成產(chǎn)品應(yīng)用于臨床,對(duì)腫瘤、乙肝、丙肝及免疫缺陷等的治療研究并取得了良好的效果。Tα1是由28個(gè)氨基酸殘基組成的酸性多肽,等電點(diǎn)4.2,相對(duì)分子量3108。

目前主要通過組織提取法和化學(xué)合成法獲得Tα1。組織提取法受到材料來源的限制，通常產(chǎn)品中有效成分含量低,從而影響治療效果。化學(xué)合成法得到的Tα1純度高，但成本高、價(jià)格昂貴,限制了Tα1的臨床應(yīng)用。有研究人員嘗試通過基因工程技術(shù)制備Tα1，但獲得的重組蛋白需要進(jìn)行蛋白酶處理，而且純化方法采用了親和層析或離子交換等方法，所以生產(chǎn)成本依然居高不下。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種制備胸腺肽α1的方法。

本發(fā)明提供的制備胸腺肽α1的方法，依次包括如下步驟：

（1）培養(yǎng)重組菌后收集菌體并進(jìn)行超聲破碎；所述重組菌為將含有胸腺肽α1基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主菌得到的重組菌；

（2）升溫至75℃并靜置30分鐘，收集上清液；

（3）用截留分子量為10000道爾頓的濾膜進(jìn)行超濾，收集濾液，即為胸腺肽α1溶液；

所述胸腺肽α1為如下是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；（b）將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有胸腺肽功能的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。

所述胸腺肽α1基因可為如下1）或2）或3）或4）或5）或6）的DNA分子：

1）編碼區(qū)如序列表中序列2自5’末端第7至90位核苷酸所示的DNA分子；

2）序列表中序列2自5’末端第7至91位核苷酸所示的DNA分子；

3）序列表中序列2自5’末端第4至90位核苷酸所示的DNA分子；

4）序列表中序列2自5’末端第4至93位核苷酸所示的DNA分子；

5）在嚴(yán)格條件下與1）至4）中任一限定的DNA序列雜交且編碼具有胸腺肽功能的蛋白的DNA分子；

6）與1）至4）中任一限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼具有胸腺肽功能的蛋白的DNA分子。

上述嚴(yán)格條件可為在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65oC下雜交，然后用2×SSC、0.1%SDS和1×SSC、0.1%SDS各洗膜一次。

所述“含有胸腺肽α1基因的重組表達(dá)載體”可為將所述胸腺肽α1基因插入pET15a（+）載體的多克隆位點(diǎn)（如NdeI和HindIII酶切位點(diǎn)之間）得到的重組質(zhì)粒。

所述宿主菌具體可為大腸桿菌BL21（DE3）。

所述步驟（1）中，所述“培養(yǎng)重組菌”的方法為：將所述重組菌在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至菌液OD_600nm=1，加入誘導(dǎo)劑并誘導(dǎo)培養(yǎng)12小時(shí)；所述誘導(dǎo)劑為異丙基-β-D-硫代半乳糖苷。所述誘導(dǎo)劑的初始濃度具體可為0.15mM。所述液體培養(yǎng)基具體可為L(zhǎng)B培養(yǎng)基。在加入所述誘導(dǎo)劑前，重組菌的培養(yǎng)條件具體可為：25℃、200轉(zhuǎn)/分(旋轉(zhuǎn)半徑為13mm)振蕩培養(yǎng)。所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)條件具體可為：25℃、200轉(zhuǎn)/分(旋轉(zhuǎn)半徑為13mm)振蕩培養(yǎng)。

所述步驟（1）中，所述超聲破碎的參數(shù)具體可為：采用Φ10探頭處理30分鐘，超聲7秒間隔5秒。

所述步驟（2）中，所述“收集上清液”的實(shí)現(xiàn)方法具體可為離心。所述離心的參數(shù)具體可為：4℃、10000g離心10分鐘。

以上任一所述方法制備得到的胸腺肽α1也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。