[發(fā)明專(zhuān)利]OB-FOLD作為支架用于工程化新的特異性結(jié)合物

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310058100.5
• 申請(qǐng)日: 2007-12-04
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103145812A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-06-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: F·佩科拉里;P·阿扎瑞
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 巴斯德研究院;國(guó)立科學(xué)研究中心
• 主分類(lèi)號(hào): C07K14/195
• 分類(lèi)號(hào): C07K14/195;C40B30/04;C40B50/06;C40B40/10
• 代理公司: 永新專(zhuān)利商標(biāo)代理有限公司 72002
• 代理人: 王健

本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2007年12月04日的申請(qǐng)?zhí)枮?00780050902.4標(biāo)題為“OB-FOLD作為支架用于工程化新的特異性結(jié)合物”的申請(qǐng)的分案申請(qǐng)

本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域。特別地，本發(fā)明提供了用于獲得特異性結(jié)合選自大量配體家族的靶的穩(wěn)定分子的手段。

大多數(shù)天然蛋白質(zhì)不適于治療或甚至生物技術(shù)應(yīng)用。蛋白質(zhì)工程的挑戰(zhàn)是限定有效和廣泛的設(shè)計(jì)新的或改良的具有所需特性的蛋白質(zhì)的方法。在靶定特性中，高特異性和親和性識(shí)別配體是非常重要的。對(duì)于許多應(yīng)用，抗體已被使用，這是由于它們特別適合于結(jié)合不同種類(lèi)的配體如蛋白質(zhì)，肽，核酸，糖等。但是由于分子復(fù)雜性和/或穩(wěn)定性不足，通常抗體或它們的衍生物片段制備困難且昂貴。由于這些原因，最近已發(fā)展了使用經(jīng)組合突變/選擇方法工程化的支架蛋白質(zhì)替代抗體的方法。目的是當(dāng)去除抗體的缺陷時(shí)維持它們的有利特性。已報(bào)道該策略的成功應(yīng)用(Binz?et?al.,2005;Mathonet?and?Fastrez,2004)，其中絕大多數(shù)的靶是蛋白質(zhì)和特別地小有機(jī)化合物。

本發(fā)明的目的是提供用于工程化能很好適用于醫(yī)學(xué)或生物技術(shù)應(yīng)用和能夠與多種靶特異性和高親和力結(jié)合的分子的工具，所述靶選自核酸，蛋白質(zhì)，碳水化合物或任何其他生物學(xué)分子。為此，本發(fā)明檢驗(yàn)假設(shè)，即命名為寡核苷酸/寡糖結(jié)合折疊區(qū)(OB-fold)的一個(gè)特殊蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可通過(guò)其結(jié)合面的殘基的隨機(jī)化而修飾，同時(shí)至少部分保留親代蛋白質(zhì)的有利生物物理學(xué)特性(即高穩(wěn)定性和折疊效率)。

由Murzin(Murzin,1993)首先描述的寡核苷酸/寡糖結(jié)合折疊區(qū)(OB-fold)在所有界中發(fā)現(xiàn)并在20個(gè)染色體調(diào)查中排名為第28個(gè)最具代表性的折疊(Qian?et?al.,2001)。這個(gè)折疊，頂上帶有一個(gè)兩性分子α-螺旋的5鏈β-桶，似乎適于多種序列。OB-fold呈現(xiàn)一個(gè)β-折疊結(jié)合面，其在可被識(shí)別的化合物類(lèi)型上賦予顯著的多樣性，所述化合物是ssDNA、dsDNA、RNA、寡糖、蛋白質(zhì)、金屬離子和催化底物。來(lái)自不同蛋白質(zhì)的幾個(gè)OB-fold的研究顯示結(jié)合核心總是位于結(jié)合面的相同位置(Arcus,2002)。

Sac7d具有OB-fold拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(圖1a)(Agback?et?al.,1998;Gao?et?al.,1998;Robinson?et?al.,1998;Su?et?al.,2000)。它屬于來(lái)自超嗜熱古細(xì)菌嗜酸熱硫化葉菌（Sulfolobus?acidocaldarius）的一類(lèi)小染色體蛋白質(zhì)。當(dāng)在DNA中誘導(dǎo)尖銳扭結(jié)（sharp?kink）時(shí)，Sac7d結(jié)合雙鏈DNA，不具有任何特定序列優(yōu)選性(Robinson?et?al.,1998)。認(rèn)為在熱硫化葉菌高生長(zhǎng)溫度時(shí)在DNA螺旋穩(wěn)定化上發(fā)揮作用。（最佳為85℃）。Sac7d非常穩(wěn)定。它耐熱并在T_m91℃解折疊，在PH0到10之間保持天然折疊，當(dāng)變性劑中點(diǎn)濃度2.8M時(shí)，鹽酸胍誘導(dǎo)的變性可逆性發(fā)生(McCrary?et?al.,1996)。與抗體相反，它的分子組織非常簡(jiǎn)單。Sac7d是66個(gè)氨基酸、只有一個(gè)結(jié)構(gòu)域(即OB-fold)和不具有二硫鍵的小單體蛋白質(zhì)(McAfee?et?al.,1995)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Sac7d的幾個(gè)截短形式(McAfee?et?al.,1995)。培養(yǎng)瓶培養(yǎng)大腸桿菌可實(shí)現(xiàn)過(guò)度生產(chǎn)水平達(dá)到可溶性蛋白質(zhì)10-15mg/l(Edmondson?and?Shriver,2001)。Sac7d和其來(lái)自硫磺礦硫化葉菌（Sulfolobus?solfataricus）的相近同系物Sso7d的結(jié)構(gòu)研究顯示兩個(gè)蛋白質(zhì)核心是重疊的并主要經(jīng)由16個(gè)殘基形成的扭曲區(qū)域結(jié)合DNA小溝(Agback?et?al.,1998;Gao?et?al.,1998;Robinson?et?al.,1998)。