[發(fā)明專利]一對(duì)扶桑綿粉蚧特異性SS-COI引物及快速PCR檢測(cè)方法和試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310058014.4
• 申請(qǐng)日: 2013-02-25
• 公開（公告）號(hào): CN103131700A
• 公開（公告）日: 2013-06-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張桂芬;田虎;王瑞;萬(wàn)方浩;馬駿;周忠實(shí)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所
• 主分類號(hào): C12N15/11
• 分類號(hào): C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 北京法思騰知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11318
• 代理人: 高宇

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明一對(duì)扶桑綿粉蚧特異性SS-COI引物及快速PCR檢測(cè)方法和試劑盒。

背景技術(shù)

扶桑綿粉蚧Phenacoccus?solenopsis?Tinsley，屬半翅目、粉蚧科、綿粉蚧屬，是一種世界性檢疫害蟲，2009年農(nóng)業(yè)部、國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局聯(lián)合發(fā)布公告將其列入《中華人民共和國(guó)進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》，并要求各出人境檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)依法加強(qiáng)對(duì)該蟲發(fā)生國(guó)家或地區(qū)寄主植物的檢驗(yàn)檢疫。扶桑綿粉蚧的寄主范圍十分廣泛，已有的研究表明它的寄主植物有53科154種，包括農(nóng)作物、園林植物、雜草和灌木等，嚴(yán)重受害的植物有錦葵科的棉花、扶桑、苘麻等；茄科的番茄、茄子、辣椒、枸杞、龍葵等；菊科的蒼耳、苦荬菜、豚草等；葫蘆科的南瓜、冬瓜、西瓜、苦瓜、絲瓜等；旋花科的空心菜（蕹菜）、甘薯、牽牛等；胡麻科的芝麻；禾本科的玉米、牛筋草等；大戟科的蓖麻；馬齒莧科的馬齒莧；苑科的野莧菜等。扶桑綿粉蚧主要以雌性成蟲和若蟲群居在寄主植物的幼嫩部位進(jìn)行刺吸為害，為害部位包括嫩枝、嫩葉、花芽和葉柄，受害棉株長(zhǎng)勢(shì)衰弱，生長(zhǎng)緩慢或停滯，失水干枯，亦可造成蕾、花、幼鈴等大量脫落；而成蟲和若蟲分泌的蜜露誘發(fā)的煤污病不僅嚴(yán)重影響植物的光合作用，還可導(dǎo)致葉片枯萎脫落，嚴(yán)重時(shí)可造成棉株成片死亡。如2005年，扶桑綿粉蚧在巴基斯坦的旁遮普省和信德省60%以上的棉花種植區(qū)域大暴發(fā)，發(fā)生面積達(dá)6750萬(wàn)畝；2006年旁遮普省棉花減產(chǎn)12%，2007年減產(chǎn)高達(dá)40%；僅在旁遮普省2個(gè)月內(nèi)使用的農(nóng)藥費(fèi)用就超過1.2億美元。

扶桑綿粉蚧原產(chǎn)于北美大陸，最早發(fā)現(xiàn)于美國(guó)新墨西哥州一家公園內(nèi)植物根部的火蟻巢中，后隨寄主植物及其它介質(zhì)傳播擴(kuò)散，陸續(xù)在美國(guó)的亞利桑納、加州等12個(gè)州以及北美洲、南美洲、非洲、澳洲、亞洲等的19個(gè)國(guó)家和地區(qū)嚴(yán)重發(fā)生，是威脅世界棉花生產(chǎn)安全的重大入侵害蟲。我國(guó)于2008年在廣東省廣州市的園林綠化植物扶桑上首次發(fā)現(xiàn)扶桑綿粉蚧，目前已在南方10個(gè)省區(qū)發(fā)現(xiàn)它的分布，對(duì)我國(guó)的棉花生產(chǎn)構(gòu)成了巨大威脅。因此，加強(qiáng)對(duì)扶桑綿粉蚧的監(jiān)測(cè)檢測(cè)，是保障我國(guó)棉花及蔬菜花卉產(chǎn)業(yè)和水果產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的必要前提。

扶桑綿粉蚧為小型昆蟲，雌雄異形，雌性成蟲卵圓形，體被白色蠟粉，體長(zhǎng)2.8-4.2mm，雄性成蟲形似蚊蟲，黑褐色，體長(zhǎng)1.2-1.5mm；卵長(zhǎng)0.32-0.34mm，橙黃色，略微透明，肉眼難以發(fā)現(xiàn)。雌性成蟲將卵產(chǎn)于生殖孔附近的棉絮狀的卵囊內(nèi)，初孵若蟲活躍，從卵囊爬出后短時(shí)間內(nèi)即可取食危害。而加強(qiáng)檢疫和監(jiān)測(cè)必需建立一套快速準(zhǔn)確的分子檢測(cè)方法。目前國(guó)際上用于扶桑綿粉蚧鑒定的方法主要有：1）形態(tài)特征鑒定；2）PCR技術(shù)等。但目前國(guó)內(nèi)針對(duì)扶桑綿粉蚧尚沒有標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)方法。

COI技術(shù)曾用于鑒別扶桑綿粉蚧及其近緣種。mtDNA?COI技術(shù)檢測(cè)是利用通用型的引物，在DNA聚合酶的催化下，對(duì)目標(biāo)DNA進(jìn)行體外擴(kuò)增，然后將PCR產(chǎn)物回收、純化、測(cè)序，根據(jù)序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建來判斷檢測(cè)結(jié)果。SS-COI?PCR技術(shù)檢測(cè)是在mtDNA?COI技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的特異序列擴(kuò)增區(qū)域標(biāo)記，是利用特異性的引物，根據(jù)預(yù)期DNA條帶的有無(wú)來判斷檢測(cè)結(jié)果，無(wú)需測(cè)序和序列比對(duì)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速、簡(jiǎn)便且重現(xiàn)性好和穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的為提供一對(duì)扶桑綿粉蚧特異性SS-COI引物。

本發(fā)明的再一目的為提供一種扶桑綿粉蚧特異性基因片段。

本發(fā)明的另一目的為提供一種扶桑綿粉蚧的特異性快速PCR檢測(cè)方法。

本發(fā)明的再一目的為提供一種扶桑綿粉蚧的特異性快速PCR檢測(cè)試劑盒。

本發(fā)明根據(jù)扶桑綿粉蚧的線粒體DNA序列，設(shè)計(jì)一對(duì)種特異性引物，該引物只對(duì)扶桑綿粉蚧具有擴(kuò)增能力。是對(duì)扶桑綿粉蚧mtDNA?COI技術(shù)檢測(cè)方法的補(bǔ)充和改進(jìn)。同時(shí)，本方法采用SS-COI?PCR技術(shù)，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏度，節(jié)約了檢測(cè)時(shí)間，在扶桑綿粉蚧檢測(cè)監(jiān)測(cè)方面具有很高的應(yīng)用價(jià)值，可以試劑盒的形式在我國(guó)口岸、有機(jī)蔬菜和有機(jī)水果生產(chǎn)基地、鮮切花生產(chǎn)基地，以及蔬菜、觀賞植物、果樹種苗/植株調(diào)運(yùn)中推廣。

根據(jù)本發(fā)明的一對(duì)扶桑綿粉蚧特異性SS-COI引物為：

SEQ?ID?No.1引物PSZTF1：5′-TTTTTGGATTTTGATCAGG-3′；和

SEQ?ID?No.2引物PSZTR1：5′-TAGCTCTTGAAAGTACTGGAATTGAAAC-3′。

根據(jù)本發(fā)明的扶桑綿粉蚧種特異性檢測(cè)方法包括使用上述SS-COI引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的步驟。