[發(fā)明專利]一對番茄潛葉蛾特異性SS-COI引物及快速PCR檢測方法和試劑盒

有效

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• 申請日: 2013-02-25
• 公開（公告）號: CN103131699A
• 公開（公告）日: 2013-06-05
• 發(fā)明（設計）人: 張桂芬;劉萬學;郭建洋;萬方浩;張毅波
• 申請（專利權）人: 中國農業(yè)科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 北京法思騰知識產權代理有限公司 11318
• 代理人: 高宇

技術領域

本發(fā)明涉及分子生物學領域，具體地，本發(fā)明一對番茄潛葉蛾特異性SS-COI引物及快速PCR檢測方法和試劑盒。

背景技術

番茄潛葉蛾Tuta?absoluta(Meyrick)，屬鱗翅目、麥蛾科，是番茄的一種世界性毀滅性檢疫害蟲，2004年被列為歐洲和地中海植物保護組織(European?and?Mediterranean?Plant?Protection?Organization,EPPO)的A1類檢疫性有害生物之一。番茄潛葉蛾為寡食性害蟲，對番茄的危害尤為嚴重，且大田和溫室均可發(fā)生；此外，亦可為害茄子、馬鈴薯、青椒、人參果、煙草等經濟作物，龍葵、銀葉葵、擬刺茄、皂味茄等非栽培茄科植物，以及多刺曼陀羅、曼陀羅、光煙草等天然茄科植物；亦有報道顯示，番茄潛葉蛾還可以為害茄科的燈籠果和豆科的豇豆，以及茄科枸杞屬和錦葵科錦葵屬的植物等。番茄潛葉蛾可在寄主植物的整個生長期進行為害，主要以幼蟲潛入寄主植物的果實、葉片以及嫩莖等組織中取食為害，以頂芽、花、幼果受害后損失最為慘重，露地及保護地番茄均可嚴重受害?；ê陀坠芎r，或造成落花落果，或招致病害原微生物寄生而腐爛，直接減產明顯；為害葉片時，幼蟲僅取食葉肉組織而留下上下表皮，并形成不規(guī)則的潛道，嚴重影響植物光合作用，最終導致葉片枯死；蛀食嫩莖形成的隧道，常使受害植株生長畸形，且易于倒折；而頂芽受害時，植株完全停止生長。為害馬鈴薯時，只取食其地上部分，不為害地下部塊莖，但會使產量明顯降低。通常，番茄潛葉蛾可在寄主植物的任何時期進行為害，但以葉片受害最為嚴重，其次為葉脈和莖，花萼及綠色的果子亦可受害，嚴重受害時植株呈火燒狀。如若不及時控制，可使番茄減產達90-100%，番茄產業(yè)（包括鮮食和深加工）遭受的經濟損失達50-100%，因此被國際馬鈴薯研究中心認定為是為害馬鈴薯葉片的最為重要的害蟲之一。

番茄潛葉蛾原產于南美洲，自二十世紀60年代以來一直是該洲番茄作物上的一種重要害蟲，其發(fā)生區(qū)域主要有阿根廷、玻利維亞、巴西、智利、哥倫比亞、厄瓜多爾、巴拉圭、秘魯、烏拉圭、委內瑞拉等10個國家。然而，自2006年底在西班牙東部首次發(fā)現(xiàn)番茄潛葉蛾為害溫室番茄以來，很快便在摩洛哥、突尼斯以及芬蘭、意大利、荷蘭、阿爾巴尼亞、阿爾及利亞、葡萄牙、保加利亞、塞浦路斯、德國、以色列、匈牙利、立陶宛、塞爾維亞、英國、俄羅斯、瑞士等近20個國家嚴重發(fā)生，近期又在希臘發(fā)現(xiàn)它的蹤跡，在地中海盆地呈迅速擴張之勢，使歐洲番茄生產遭受了嚴重打擊，堪稱世界番茄和馬鈴薯產業(yè)的一種毀滅性害蟲。此外有研究顯示，1962年日本曾有疑似番茄潛葉蛾為害野茄子的報道，之后未曾提及，故其在日本的發(fā)生尚有待商榷。目前，我國尚未有番茄潛葉蛾的發(fā)生，因此加強對番茄潛葉蛾的檢疫檢驗，是保障我國番茄和馬鈴薯、煙草等產業(yè)健康發(fā)展的首要前提。

番茄潛葉蛾為小型蛾類昆蟲，成蟲體長6-7mm；卵長0.36mm，寬0.22mm，圓柱形，奶白色至桔黃色，肉眼難以發(fā)現(xiàn)。雌性成蟲主要將卵產于葉片背面，亦可產在葉片正面、芽、莖或綠色的果子上，幼蟲一經孵化即潛入葉片、莖稈或果實內進行取食為害；老熟幼蟲可在土中化蛹，亦可在葉片表面或潛道內化蛹。而加強檢疫和監(jiān)測必需建立一套快速準確的分子檢測方法。目前國際上用于番茄潛葉蛾鑒定的方法主要有：1）形態(tài)特征鑒定；2）PCR技術等。但目前國內針對番茄潛葉蛾尚沒有標準的檢測方法。

RAPD和ITS、COI技術曾用于區(qū)分番茄潛葉蛾的不同地理種群。RAPD技術檢測是以基因組DNA為模板，以單條人工合成的隨機多態(tài)核苷酸序列為引物，在DNA聚合酶的催化下，進行PCR擴增，擴增產物經瓊脂糖或聚丙烯酰胺電泳分離、溴化乙錠染色后，在紫外透視儀上根據(jù)多態(tài)性來判斷檢測結果。rDNA?ITS技術和mtDNA?COI技術檢測是利用通用型的引物，在DNA聚合酶的催化下，對目標DNA進行體外擴增，然后將PCR產物回收、純化、測序，根據(jù)序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹構建來判斷檢測結果。SS-COI?PCR技術檢測是在mtDNA?COI技術的基礎上發(fā)展起來的特異序列擴增區(qū)域標記，是利用特異性的引物，根據(jù)預期DNA條帶的有無來判斷檢測結果，無需測序和序列比對，具有靈敏度高、特異性強、快速、簡便且重現(xiàn)性好和穩(wěn)定性強等優(yōu)點。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的為提供一對番茄潛葉蛾特異性SS-COI引物。

本發(fā)明的另一目的為提供一種番茄潛葉蛾的特異性快速PCR檢測方法。

本發(fā)明的再一目的為提供一種番茄潛葉蛾的特異性快速PCR檢測試劑盒。