[發明專利]大規模篩查CCR5-Δ32基因型的方法及其引物

有效

• 申請號: 201310055046.9
• 申請日: 2013-02-20
• 公開（公告）號: CN103122388A
• 公開（公告）日: 2013-05-29
• 發明（設計）人: 高勁松;張英杰
• 申請（專利權）人: 沈陽優吉諾生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 沈陽晨創科技專利代理有限責任公司 21001
• 代理人: 張晨

技術領域

本發明屬于基因檢測領域，特別提供一種大規模篩查人CCR5-Δ32基因型的方法及其引物。

背景技術

艾滋?。ˋcquired?Immune?Deficiency?Syndrome，AIDS）即獲得性免疫缺陷綜合癥，是人類免疫缺陷病毒（Human?Immunodeficiency?Virus，HIV）感染人體后導致免疫缺陷，并發一系列感染及腫瘤，可導致死亡的綜合征。目前，艾滋病已成為嚴重威脅世界人民健康的公共衛生問題，在我國的流行情況也十分嚴峻。艾滋病毒分為HIV-1和HIV-2兩種基因型，HIV-1是世界上的主要流行的類型。

HIV-1病毒感染T淋巴細胞，除了需要CD4分子作為受體外，還需要CCR5和CXCR4等的一些分子作為輔助受體(coreceptor)，只有這些輔助受體與CD4分子同時存在才能感染特異的CD4+T細胞。根據HIV-1需要的輔助受體是CCR5或是CXCR4，把HIV-1又分為R5株和X4株，其中又以需要輔助受體CCR5的R5株為多見，因此對CCR5的研究一直是一大熱點。

CCR5是一種趨化因子受體，趨化因子是一類具有趨化活性的小分子細胞因子，其功能在于使細胞表面具有跨膜G蛋白偶聯受體的細胞聚集在一起，參與體內的免疫平衡作用。CCR5由352個氨基酸殘基組成，分子量為40.6kDa，大致可分為：胞外N末端，3個胞外環(EL1-3)，3個胞內環(IL1-3)，7個跨膜α螺旋和胞內C末端構成。具有調控T細胞和單核巨噬細胞遷移、增殖與免疫的功能，主要表達于T細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞等的細胞膜上。

在CCR5基因中存在多種不同的基因多態性，其中CCR5-Δ32的基因型有著十分重要的價值。CCR5-Δ32是指CCR5基因中發生了32個堿基的缺失，即在CCR5基因編碼區域第185位氨基酸密碼子后的3317～3348位置發生32個堿基丟失了，產生基因讀碼框架的錯位，從而不能合成正常的CCR5蛋白，在細胞膜上也就沒有有功能的CCR5出現，HIV-1病毒就不能感染宿主細胞。CCR5-Δ32包括純合子和雜合子兩種，純合子是兩個等位基因的DNA鏈都發生了缺失，雜合子是兩個等位基因中僅有一個等位基因的CCR5?DNA鏈發生了丟失，另一個等位基因正常。但CCR5-Δ32缺失的個體擁有正常的免疫功能，因此CCR5-Δ32仍劃歸在SNP（單核苷酸多態性）的范圍內。

攜帶CCR5-Δ32基因型者，感染HIV的幾率大大降低，CCR5-Δ32能夠有效抵抗HIV-1的病毒感染以及延緩病情的惡化，使其疾病進展的速度緩慢。純合子CCR5-Δ32/Δ32的個體對HIV的感染有抗性，而雜合子CCR5-+/Δ32的個體可顯著的推遲艾滋病的發生。2009年國際著名期刊《新英格蘭醫學雜志》雜志報道了一個轟動性的個案，一位艾滋病病人接受了一位CCR5-Δ32基因型的骨髓移植，從而治愈了艾滋病，這是全球第一位獲得完全治愈的成功范例，具有里程碑式的意義。

從第一位艾滋病治愈的例子中，我們得到一個重要的啟示，那就是在人群中尋找和發現CCR5-Δ32基因型的攜帶者，然后獲得他們的骨髓樣品，或者獲得他們的外周血樣品，通過目前的誘導干細胞技術（IPSC）獲得可供移植的干細胞，從而移植給其基因配型一致的艾滋病病人，達到治愈病人的目的。但遺憾的是CCR5-Δ32在人群中的發生率不高，不同的種族有不同的陽性率，在漢族人群中據有限的調查，報告其陽性率為0.119%，而在歐洲白人中陽性率可在5-14%之間，在我國的新疆維吾爾族人群中陽性率會在3.48%左右。因此要尋找和發現CCR5-Δ32基因型的攜帶者，必須對大量人群進行篩選，這就要求篩查的方法技術具備簡單、快速、價廉、準確并易于在基層推廣的特點?；诖耍覀儼l明了如下的方法技術和大量篩查的方案。

目前對基因突變的檢測都離不開PCR技術。簡單的說，PCR就是利用DNA聚合酶對特定基因做體外的大量合成，通過DNA聚合酶對一對引物間的DNA序列特異性的復制，可以將一段基因放大為原來的一百億至一千億倍。主要通過變性、退火和延伸三個步驟，經30到40次的重復循環，在2～3小時就能將待擴目的基因片段復制到成百上千億倍。PCR反應中，最重要的是引物的設計，它決定了擴增的成敗和擴增片段的特異性，理論上講，一個引物只能結合到DNA的特定位置，一對引物只能擴增出一個特定的基因片段。