[發明專利]一種在白術生長期檢測抗性標志物的方法

有效

• 申請號: 201310054049.0
• 申請日: 2013-01-19
• 公開（公告）號: CN103940919B
• 公開（公告）日: 2017-08-25
• 發明（設計）人: 田薇;王春榮;李倩;蔣鵬
• 申請（專利權）人: 浙江農林大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 杭州君度專利代理事務所(特殊普通合伙)33240
• 代理人: 王桂名

1.一種在白術生長期檢測抗性標志物的方法，其特征在于：

A種植白術，按常規進行田間管理，于5-7月白術土傳病害高峰期采集自然狀態下抗病植株A1與感病植株A2各30株以上，去除泥土，低溫干燥，作為測試樣品，備用；

B采用傷根法接種羅氏白絹小菌核菌，1-3周后分別采健康B1和發病植株B2各30株以上，去除泥土，低溫干燥，作為測試樣品，備用；

C采用HPLC法測定A步驟和B步驟的樣品中白術內酯類的含量值，并采用單因素T檢驗分析A1與A2、B1與B2組間水平的差異，確定在白術抗病植株與健康植株中明顯高表達的代謝物為白術內酯II，并進一步采用對照品追加法鑒定此代謝物為白術內酯II；

HPLC法測定的條件為：色譜條件色譜柱：Sun Fire C18，250mm×4.6mm，5μm，流動相甲醇A-水B，梯度洗脫程序為0～16min，60％～76％A；16～18min，76％～100％A；18～30min，100％A；體積流量1mL/min，柱溫25℃，白術內酯I、III檢測波長為220nm、白術內酯II檢測波長為276nm，進樣量20μL；對照品溶液的制備：精密稱取白術內酯I、II、III對照品適量，用甲醇配制成含有白術內酯I、II、III分別為0.266、0.100、0.341mg/mL的混合對照品溶液；供試品溶液的制備：精密稱取白術樣品粉末0.5g，加入8mL甲醇，超聲30min，靜置后用甲醇定容至10mL，搖勻，得50mg/mL的供試品溶液；

D采用體外抑菌實驗驗證候選標志物對白術致病菌的抑制活性，以羅氏白絹小菌核菌為受試菌種，分別測試對該致病菌的毒力，與白術內酯I、白術內酯III比較，明確白術內酯II有明顯的抑制作用，實驗證實代謝物白術內酯II為與白術抗病性有關的標志物；

其中體外抑菌驗證方法步驟如下：分別取0.01ml不同濃度甲醇母液內酯I，II，III于10ml培養基中，使成200、100、50、25、12.5μg/ml的培養基；采用生長速率法進行毒力測定；以羅氏白絹小菌核菌為供試菌種；無菌條件下在各個病原菌菌落邊緣用打孔器打取菌餅直徑分別接種于各處理培養基平板中央每皿接1個菌餅，每處理3次重復，25℃培養72小時，采用十字交叉法測量菌落直徑，應用DPS軟件進行統計分析，計算毒力回歸方程、有效中濃度及相關系數。

2.根據權利要求1所述的在白術生長期檢測抗性標志物的方法，其特征在于：白術內酯II在具有抗病能力的白術中明顯高表達，并與白術抗土傳病害相關。

3.根據權利要求1所述的在白術生長期檢測抗性標志物的方法，其特征在于：采集白術感病植株和健康植株樣品為6月份白術土傳病害高發期。