[發明專利]一種菲利普孢囊線蟲LAMP快速檢測方法及應用

有效

• 申請號: 201310053055.4
• 申請日: 2013-02-18
• 公開（公告）號: CN103103285A
• 公開（公告）日: 2013-05-15
• 發明（設計）人: 彭德良;徐小琴;彭煥;黃文坤;亓曉莉;姜道宏
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京兆君聯合知識產權代理事務所(普通合伙) 11333
• 代理人: 胡敬紅

1.一種菲利普孢囊線蟲LAMP快速檢測方法，其特征在于：其中LAMP反應體系所使用的引物是：

①HF11-F3：5`-GGCAGCGATCAAAAGACT-3`；

②HF11-B3：5`-AAATGTGATGTTCCCAAGTG-3`;

③HF11-BIP：5`-GAGTCCTTTTGTTTAGCATGGGTT-GGAGCCATGTTATTTTGTTGA-3`;

④HF11-FIP：5`-TCTTGGTGCCCAAACTTCCC-GCATCTAACATTCTCAATAATTGTC-3`;

⑤HF11-LF：5`-GGGGCCAAAGAATGTGTAAATCAAT-3`;

⑥HF11-LB：5`-TTTAGCGCCCATTTAAGCGT-3`。

2.根據權利要求1所述的檢測方法，其中的LAMP反應體系包括：

1）引物混合液：外引物HF11-F3和HF11-B3各0.2μmol/L，內引物HF11-FIP和HF11-BIP各1.4μmol/L,環引物HF11-LF和HF11-LB各為0.4μmol/L；

2）反應混合液：3.2mmol/L?dNTP,20mmol/L且pH8.8的Tris-HCl,10mmol/L?KCl,3mmol/L?MgS04,10mmol/L(NH4)2S04,0.1%Triton?x-100,8U?Bst?DNA大片段聚合酶；

3）1μl?DNA模板；

加滅菌雙蒸餾水補全到25μl。

3.根據權利要求2所述的檢測方法，其中LAMP反應條件如下：將引物混合液和反應混合液混合均勻后加入1μl?DNA模板，61～65℃溫育30～90min，85℃保溫10min。

4.根據權利要求3所述的檢測方法，其中LAMP反應的最終產物中加入有顯色劑，輕甩離心管即可肉眼觀察。

5.根據權利要求4所述的檢測方法，所述顯色劑為SYBR?green?I與PCR級DMSO的混合物，其體積比為1：9。

6.根據權利要求2所述的檢測方法，所述DNA模板的提取方法為：挑取單個菲利普孢囊放入裝有10μl?ddH2O的0.2mL離心管中，液氮冷凍，取出后置于冰上，用滅菌的玻璃棒在離心管中轉動至冰融化，將孢囊捅破，釋放出卵，加入8μl的LB溶液，2μl的600μg/ml蛋白酶K溶液，然后在-80℃冷凍30min；將離心管取出，在65℃溫育90min，95℃反應10min處理后以上清液作為線蟲DNA模板直接用于LAMP反應，所述LB溶液為500mmol/L?KCl，10mmol/L?Tris-HCl，15mmol/L?MgCl2，1.0mmol/L?DTT，4.5%Tween20，等體積混勻，過濾滅菌。

7.權利要求1-6所述任一檢測方法在診斷罹病植物、土壤的菲利普孢囊線蟲感染情況或鑒別菲利普孢囊線蟲中的應用。