[發(fā)明專利]一種快速構(gòu)建差異表達基因文庫的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310052404.0
• 申請日: 2013-02-18
• 公開（公告）號: CN103114086A
• 公開（公告）日: 2013-05-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊金龍;劉作華;黃勇;張素輝;楊睿;張邑帆;鄭華;李成洪;楊晶旭
• 申請（專利權(quán)）人: 重慶市畜牧科學(xué)院;楊晶旭
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C40B50/06;C40B40/08
• 代理公司: 北京同恒源知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11275
• 代理人: 趙榮之

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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種快速構(gòu)建差異表達基因文庫的方法。

背景技術(shù)

抑制性消減雜交(suppression?subtractive?hybridization，SSH)技術(shù)是1996年DiatchenkoL等設(shè)計出的以抑制性PCR和消減雜交技術(shù)為基礎(chǔ)的一種尋找差異表達基因的方法，具有穩(wěn)定、靈敏等特點，是目前最具應(yīng)用前景的研究工具之一，在新基因的分離鑒定中顯示了重要的價值，得到了廣泛的應(yīng)用。但此技術(shù)存在以下缺陷：①富集的cDNA片段克隆時仍有10-40%左右的假陽性(Gurskaya?NG,?Diatchenko?L,?Chenchik?A.,?et?al.?Equalizing?cDNA?subtraction?based?on?selective?suppression?of?polymerase?chain?reaction:?cloning?of?Jurkat?cell?transcripts?induced?by?phytohemaglutinin?and?phorbol?12-myristate?13-acetate.?Anal?Biochem.?1996；1:?90-97)；②雖然該法富集了差異表達基因，但是一些基因被多次重復(fù)克隆、檢測，導(dǎo)致庫容“虛增”；③該法無法預(yù)知多大的文庫庫容可以包含所有的差異基因，使檢測到的表達基因偏少；④此法操作步驟多且成本偏高，普通實驗室無力進行。上述原因?qū)е聦蛭膸斓姆治鰳O易出現(xiàn)誤差，也限制了此技術(shù)的更廣泛應(yīng)用（曾勇，陸承平．cDNA微陣列結(jié)合抑制性差減雜交研究對蝦白斑綜合癥病毒部分表達基因．病毒學(xué)報．2004；3：255-260)。因此，完善SSH技術(shù)，消除上述缺陷，為新基因的發(fā)現(xiàn)與功能研究提供更為完美、可靠的技術(shù)支持具有重要的科學(xué)意義。??????

變性梯度凝膠電泳技術(shù)（DGGE，Denaturing?Gradient?Gel?Electrophoresis）通過核酸片段在變性條件下不同程度解鏈，從而導(dǎo)致這些片段在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移速率不同以此來顯示核酸片段多樣性的技術(shù)。DGGE技術(shù)具有如下優(yōu)點：①雙鏈DNA在變性梯度凝膠（變性劑濃度從小到大）的泳動過程中，其解鏈的速度和程度與其序列密切相關(guān)，在恰當(dāng)?shù)臈l件下，只要有一個堿基對的差異即可相互分開，應(yīng)用“GC夾板”技術(shù)還可使大于500bp的DNA片段檢出率提高到100％，能得到幾乎所有微生物DNA多樣性的信息，在微生物生態(tài)學(xué)的研究中得到了廣泛的應(yīng)用；②更為可貴的是，電泳凝膠上的條帶可以在回收后直接測序，由于能檢測出有差異的條帶，不會出現(xiàn)重復(fù)測序以及漏檢現(xiàn)象，從而能夠構(gòu)建“精確基因文庫”；③由于取消了PCR產(chǎn)物克隆程序，也就不會出現(xiàn)因克隆而導(dǎo)致假陽性的現(xiàn)象；④實驗成本大幅度降低。但由于DGGE技術(shù)“能檢異而不富異、不消同”，不能檢測出某些豐度低于1%的基因，而恰恰這些豐度低于1%的基因往往就是關(guān)鍵的功能基因，由于未能得到“富集”而得不到檢測，使其未能在構(gòu)建差異表達基因文庫中得到應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的是提供一種快速構(gòu)建差異表達基因文庫的方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)的上述缺點，從而為尋找差異表達基因提供科學(xué)的依據(jù)和指導(dǎo)作用。

為達到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種快速構(gòu)建差異表達基因文庫的方法，包括如下步驟：

a.提取感染鵝細(xì)小病毒和未感染鵝細(xì)小病毒鵝法氏囊的總mRNA；

b.利用步驟a所得總mRNA合成雙鏈cDNA，然后進行酶切消化，得酶切消化的雙鏈cDNA；

c.將步驟b所得酶切消化的雙鏈cDNA分為2管，分別添加不同的接頭進行連接，得加有接頭的雙鏈cDNA；

d.將步驟c所得加有接頭的雙鏈cDNA先進行正向消減雜交，然后將正向消減雜交產(chǎn)物進行反向消減雜交，得反向消減雜交產(chǎn)物；

e.以步驟d所得反向消減雜交產(chǎn)物進行第一次PCR擴增，然后將擴增產(chǎn)物稀釋，并以稀釋液為模板進行第2次PCR擴增；

f.將步驟e中第2次PCR擴增的產(chǎn)物進行變性梯度凝膠電泳，電泳后進行染色，得鵝細(xì)小病毒脅迫法氏囊差異表達基因文庫。

優(yōu)選的，所述步驟b是利用步驟a所得總mRNA加入隨機引物，先合成第一鏈cDNA，然后合成第二鏈cDNA，然后用Rsa?I進行酶切消化，得酶切消化的雙鏈cDNA。