[發(fā)明專利]一種雙酚A單鏈抗體及其用途

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310051416.1
• 申請(qǐng)日: 2013-02-17
• 公開（公告）號(hào): CN103992407A
• 公開（公告）日: 2014-08-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 寧保安;彭媛;白家磊;高志賢;趙麗;孫思明
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所
• 主分類號(hào): C07K16/44
• 分類號(hào): C07K16/44;G01N33/53
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種抗雙酚A單鏈抗體，其特征在于可以特異識(shí)別小分子物質(zhì)雙酚A。?

2.權(quán)利要求1抗雙酚A單鏈抗體制備方法，由如下步驟組成：?

(1)抗雙酚A單鏈抗體的篩選?

將擴(kuò)增得到的全文庫經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯后，用于BPA-OVA或BPA-BSA作為半抗原固相交替篩選特異于BPA的單鏈抗體，每輪篩選的過程中都采用了復(fù)篩選法。篩選完成以后，調(diào)節(jié)Mg2+濃度將篩選得到的單鏈抗體-核糖體-mRNA三聯(lián)體解離，得到相應(yīng)的mRNA，經(jīng)過RT-PCR得到篩選后的DNA文庫。得到的DNA文庫與核糖體展示元件T啟動(dòng)子和P蛋白連接，構(gòu)成篩選的全文庫，再經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄、體外翻譯、親和篩、RT-PCR擴(kuò)增過程，反復(fù)篩選幾輪后的到單鏈抗體的文庫。經(jīng)過五輪篩選后，得到的mRNA經(jīng)紫外分光光度法測(cè)定，結(jié)果顯示吸光度明顯增加，且RT-PCR擴(kuò)增得到的DNA條帶亮度明顯增加，說明篩選后的抗體文庫中抗原陽性的抗體得到了富集。?

Mg2+濃度根據(jù)篩選條件的嚴(yán)謹(jǐn)性不同進(jìn)行調(diào)整。?

(2)抗雙酚A單鏈抗體的功能性表達(dá)?

篩選得到的單鏈抗體進(jìn)行序列鑒定，挑選出無致死突變的克隆子，將單鏈抗體基因與pTIG-TRX連接成表達(dá)載體，在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳鑒定，在27.8KDa處有目的蛋白條帶，與理論蛋白大小一致，破碎后確定表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體的形式存在于沉淀中，需要對(duì)包涵體進(jìn)行變復(fù)性獲得有生物活性的單鏈抗體。?

抗體的表達(dá)可以采用原核表達(dá)載體如pBV220，pET系列載體，優(yōu)選pTIG-TRX。?

標(biāo)簽蛋白可以為麥芽糖結(jié)合蛋白、6×組氨酸標(biāo)簽等，優(yōu)選6×組氨酸標(biāo)簽。?

(3)抗雙酚A單鏈抗體的鑒定?

將陽性克隆子表達(dá)后的包涵體復(fù)性后使用間接ELISA和競(jìng)爭(zhēng)間接ELISA法進(jìn)行鑒定，結(jié)果篩選出兩株克隆子對(duì)雙酚A具有競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合活性，對(duì)其進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果表明CDR區(qū)有相似性。?

3.權(quán)利要求2中所述核糖體展示元件中的啟動(dòng)子根據(jù)體外翻譯系統(tǒng)的不同可以為原核啟動(dòng)子(T7啟動(dòng)、tac啟動(dòng)子等)，優(yōu)選原核啟動(dòng)子特別是T7啟動(dòng)子。?

4.權(quán)利要求2中所述篩選方法可以采用BPA-BSA、BPA-OVA進(jìn)行固相篩選，并且在篩選的過程中采用了復(fù)篩選法，優(yōu)選在不同篩選輪次中采用不同包被原交叉篩選。?

5.權(quán)利要求2中所述抗體的表達(dá)可以采用原核表達(dá)載體如pBV220，pET系列載體，并根據(jù)載體不同選擇不同表達(dá)宿主，優(yōu)選pTIG-TRX載體。?

6.權(quán)利要求2中所述標(biāo)簽蛋白可以為麥芽糖結(jié)合蛋白、6×組氨酸標(biāo)簽等，優(yōu)選6×組氨酸標(biāo)簽。?