[發明專利]富集短鏈核酸的方法

在審

• 申請號: 201310050616.5
• 申請日: 2006-12-08
• 公開（公告）號: CN103173436A
• 公開（公告）日: 2013-06-26
• 發明（設計）人: C·瑞特;R·西麥爾里奇;M·韋伯
• 申請（專利權）人: 恰根有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/113
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 韋東

本發明專利申請是國際申請號為PCT/EP2006/069484，國際申請日為2006年12月08日，進入中國國家階段的申請號為200680046308.3，名稱為“富集短鏈核酸的方法”的發明專利申請的分案申請。

本發明涉及富集長度小于300個核苷酸的核酸的方法，涉及用于富集長度小于300個核苷酸的核酸的試劑盒，涉及所述試劑盒的用途，涉及陰離子交換基質的用途并涉及治療疾病的方法。

若干年前，由于發現小的核糖核酸(RNA)執行了基因表達的實質調節功能，因此科學研究日益集中于短于300個核苷酸，尤其是短于100個核苷酸的小RNA。更具體地說，許多研究者已經對微小RNA(miRNA)感興趣。miRNA是一類在進化上保守的長度約22個核苷酸的小的非編碼RNA，其在調節基因表達中的復雜作用正變得越來越明顯。已在所研究的所有真核生物和幾乎所有組織中發現miRNA，其中包括真菌、植物、昆蟲和哺乳動物。除了miRNA，還已經發現其它小RNA在細胞功能中也扮演重要角色。這些小RNA包括，例如，小干擾RNA(siRNA)、核小RNA(snRNA)和核仁小RNA(snoRNA)。

這些短于300個核苷酸的短RNA必須盡可能純并以高產率從要研究的生物系統中純化，這樣才能夠研究它們的細胞作用。因此迫切需要提供能夠從復雜生物系統、尤其從細胞裂解物中純化和分離這種短RNA的方法。

通常，為分離生物樣品中的核酸，必須將它們與剩余的細胞組分如蛋白質、糖類、脂質和其它組分分離。現有技術已經披露了多種從非常不同的原料，如從細胞培養物、從植物和動物來源的組織、以及從體液分離核酸的方法。例如，一種方法包括在有機溶劑如酚和氯仿的幫助下提取通常為水性的原始溶液(Chomczynski和Sacchi，1987)，然后在醇類如乙醇或異丙醇的幫助下從水相中沉淀核酸(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.in?T.Maniatis，CSH，Molecular?Cloning，1989)。另一種方法包括將核酸固定于固相，例如通過硅吸附技術。不利的是，所有這些方法不能、或不足以分離或至少純化相對較小的核酸。

為解決該問題，現有技術已經披露了專門富集小RNA群體的方法，該方法基于硅膜技術。在這些方法中，在將細胞裂解之后在細胞裂解物中加入相對小量的醇，在離液結合條件下至少部分相對較長的核酸可結合于硅膜。然而，現有技術所述純化方法中所用醇的量過低，因此不能使小核酸也有效結合于硅膜，因此這些小RNA出現在流出液中。然后提高流出液的醇濃度，然后再結合第二硅膜。洗滌步驟之后，小RNA與未結合于第一柱的所有其它核酸一起被洗脫(參見，例如，來自美國奧斯汀安拜恩公司(Ambion，Austin，USA)的試劑盒或來自德國希爾登恰根公司(QIAGEN，Hilden，Germany)的脂組織迷你試劑盒，使用方法見使用手冊)。

恰根與安拜恩法的缺點在于需要使用兩種固相，且通過單次結合步驟無法僅獲得所需的小RNA。此外，例如，如果不同時分離tRNA和其它較大核酸，則該方法無法分離大小約22個核苷酸的miRNA。盡管在某些條件下通過該方法可以富集小RNA，尤其是miRNA達到一定程度，但所述小RNA仍會被其它核酸尤其被轉運RNA(tRNA)污染。

本發明的目的是克服現有技術的缺點。

更具體地說，本發明的目的是提供一種富集(enrich)小核酸，尤其是miRNA的方法，例如，該方法能夠采用盡可能少的方法步驟從復雜的生物組合物如細胞裂解物中富集小核酸。

本發明的再一個目的是提供一種純化小核酸的方法，例如，該方法不僅能夠從復雜生物組合物如細胞裂解物中長度大于300個核苷酸的核酸或其它組分中除去長度為25個核苷酸或更小的特定核酸，還能夠從長度小于300且大于25個核苷酸的其它核酸如tRNA中特異性除去這些小核酸。

本發明還提供了一種可用于盡可能單獨產生所需大小的RNA的方法。

本發明的再一個目的是提供一種無需改變反應容器的方法－通過“單容器反應(one-pot?reaction)”－從而將待分析樣品的混合風險降至最低。

本發明的再一個目的是提供一種試劑盒，在該試劑盒的幫助下能夠如上所述從復雜生物組合物中有利地純化小核酸，尤其是小RNA。

一種富集長度小于300個核苷酸，優選小于200個核苷酸，更優選小于100個核苷酸，再優選小于50個核苷酸，最優選小于25個核苷酸的核酸的方法為解決一開始提到的問題做出了貢獻，所述方法包括以下步驟：