[發明專利]用于刺激樹突狀細胞成熟的組合物以及方法

有效

• 申請號: 201310049402.6
• 申請日: 2013-02-07
• 公開（公告）號: CN103173410A
• 公開（公告）日: 2013-06-26
• 發明（設計）人: 夏建川;潘科
• 申請（專利權）人: 夏建川
• 主分類號: C12N5/0784
• 分類號: C12N5/0784;A61K35/14;A61P35/00
• 代理公司: 廣州三環專利代理有限公司 44202
• 代理人: 劉孟斌

技術領域

本發明屬于細胞生物學、腫瘤免疫學和腫瘤免疫治療領域，涉及人樹突狀細胞培養方法，尤其是涉及一種用于刺激樹突狀細胞成熟的組合物以及相關的和刺激樹突狀細胞成熟的的方法。?

背景技術

樹突狀細胞（DC）是免疫系統內最強大的抗原呈遞細胞（APC）。通過抗原攝取、加工及呈遞，DC細胞可有效誘導抗原特異性CD4及CD8?T細胞活化，從而激活獲得性免疫反應。此外，DC細胞同樣可激活NK細胞，增強其增殖能力及殺傷功能，從而增強先天免疫應激反應。因此，如何提高DC細胞的生物學活性，特別是充分發揮DC細胞在腫瘤免疫治療中的作用受到醫務工作人員的極大關注。在最近的一項III期臨床試驗中，接受DC疫苗治療的腫瘤患者表現出腫瘤進展延緩、疾病穩定同時生存期延長，證實了DC疫苗在腫瘤免疫治療中所發揮的作用。然而，盡管已經取得了一些好的結果，但現階段的DC疫苗對于腫瘤患者的臨床緩解率仍然很低。因此，有必要對現有DC細胞培養體系進行進一步完善，以有效提高DC疫苗在臨床治療腫瘤中的作用。?

負載腫瘤相關抗原的成熟DC細胞（MDC）比未成熟的DC細胞（iDC）具有更強的刺激T淋巴細胞產生特異抗腫瘤免疫應答。許多微生物產物如脂多糖（LPS）、雙鏈RNA（dsRNA）以及炎癥細胞因子如TNF-α均可刺激DC細胞成熟。在抗腫瘤免疫反應中，Th1免疫反應被認為在抗腫瘤免疫中發揮重要作用；而Th2以及Treg反應則被認為起負面的作用。在這個過程中，DC細胞分泌的IL-12p70水平起了關鍵性的作用。高水平的IL-12被證實可有效極化Th1細胞的產生，從而輔助誘導抗原特異性的CD8+CTL細胞生成。此外，IL-12還可直接作用CD8+T細胞使其進行克隆增殖，擴大效應功能以及建立免疫記憶群。因此，能夠分泌高水平的IL-12是DC細胞生物活性高的標志之一。然?而，盡管目前已經發現有很多制劑能夠誘導DC細胞分泌IL-12，但其持續的過程很短暫，在撤去刺激物后，DC細胞分泌IL-12的能力很快在后續培養中消失。這種現象被稱之為“DC細胞衰竭”。而在無血清培養體系中，“DC細胞衰竭”現象尤為突出。“DC細胞衰竭”現象可能也部分解釋了現階段DC疫苗在臨床腫瘤治療中表現出來的緩解率較低的重要原因之一。如最近的一項III期臨床試驗，采用了所謂“金標準”的成熟劑組合，其中包含了IL-1、IL-6、TNF-α以及PEG2，制備成熟的DC細胞疫苗。但在針對晚期的黑色素瘤患者治療中，并未使療效顯著提高。研究者認為一個可能的原因是使用了PGE2，雖然能夠提高DC細胞CCR7的表達水平并增強其向二級淋巴結遷移的能力，但是卻會顯著抑制IL-12的生成，造成嚴重的“DC細胞衰竭”現象。因此，有必要尋求更為優化的DC細胞培養方法，使DC細胞能夠穩定分泌IL-12，從而在體內誘導更有效的抗腫瘤免疫反應。?

長期以來，如何在樹突狀細胞培養過程中提高樹突狀細胞（DC）的生物學活性，有效刺激T淋巴細胞增生，誘導產生更強的抗腫瘤的特異性免疫應答一直是困擾人們的一大難題。由于這一技術的難于解決，使得樹突狀細胞在臨床腫瘤治療中受到極大的限制，臨床治療腫瘤患者的緩解率很低。如何在樹突狀細胞培養過程提高其生物學活性，使其能有效刺激的T淋巴細胞能大量擴增，并誘導產生更強的抗腫瘤的免疫應答是目前研究的熱點。到目前為止，大量研究表明：樹突狀細胞疫苗在臨床腫瘤治療中對腫瘤患者的緩解率低的最主要原因是培養的樹突狀細胞的生物學活性難于持續維持，造成嚴重的所謂“DC細胞衰竭”，從而難于誘導機體產生強大的抗腫瘤免疫反應。?

臨床級藥物OK-432在過去的研究中已被證實是DC細胞一種有效的成熟劑，可增強DC細胞表面標記物的表達以及炎癥細胞因子的分泌，進而有效誘導抗腫瘤免疫反應。然而，這種方法僅僅是發現在OK-432刺激物存在的情況下，DC細胞能夠分泌高水平的IL-12；在撤去OK-432刺激物后，DC細胞分泌IL-12的能力明顯降低，特別是在無血清培養體系中，這種現象表現的更為突出。?

發明內容

本發明的目的在于提供一種用于刺激樹突狀細胞成熟的組合物，采用該組合物刺激樹突狀細胞（DC）所制備的成熟DC細胞具有持續分泌IL-12的能力，能持續保持樹突狀細胞的生物學活性，進而能更有效地誘導Th1的抗腫瘤免疫及抗腫瘤特異性細胞毒性T淋巴細胞（CTL）反應。?

本發明所述的用于刺激樹突狀細胞成熟的組合物，包括OK-432與IFN-γ，在每毫升樹突狀細胞培養液中，OK-432的用量是5-10μg/ml，IFN-γ的用量是500-1000U/ml。?