[發明專利]一種聚乙二醇修飾的重組人白介素2的制備方法

無效

• 申請號: 201310049286.8
• 申請日: 2013-02-07
• 公開（公告）號: CN103193879A
• 公開（公告）日: 2013-07-10
• 發明（設計）人: 徐東;葉垚平
• 申請（專利權）人: 深圳市亞太興實業有限公司
• 主分類號: C07K14/55
• 分類號: C07K14/55;C07K1/107
• 代理公司: 深圳中一專利商標事務所 44237
• 代理人: 張全文

技術領域

本發明屬于生物醫藥領域，尤其涉及一種聚乙二醇修飾的重組人白介素2的制備方法。?

背景技術

白介素(interleukin)，白細胞介素的簡稱，是指在白細胞或免疫細胞間相互作用的淋巴因子，它和血細胞生長因子同屬細胞因子。兩者相互協調，相互作用，共同完成造血和免疫調節功能。白細胞介素在傳遞信息，激活與調節免疫細胞，介導T、B細胞活化、增殖與分化及在炎癥反應中起重要作用。?

白介素－2即白細胞介素－2(interleukin-2，IL-2)，是白介素家族中的一員，又名T細胞生長因子，主要由活化的CD4+T細胞和CD8+T細胞產生，其具有廣泛生物活性，可以作用于所有T細胞亞群。重組人白介素－2(rhIL-2)，通常由原核表達載體表達，與白介素IL-2相比，重組人白介素-2在N末端多一個甲硫氨酸Met，其具有人白介素-2的主要功能，可促進T淋巴細胞增殖，激活淋巴因子激活的殺傷細胞(LAK細胞)，促進β－干擾素的產生，對免疫應答的產生和調節有重要作用，是目前調控免疫應答的重要因子，臨床上已顯示出具有較好的抗腫瘤活性。?

在用作外源蛋白質藥物時，由于其具有不同于人白介素-2的結構，屬于天然抗原，具有較強的免疫原性，反復注射會引發受試者的免疫反應，使得患者依從性較差。此外還會受到各種蛋白酶的攻擊而容易失去生物活性，且生物半衰期短，無法充分發揮其生物活性，且為了維持其在體內有效的血藥濃度，需要多次給藥，導致患者依從性差，嚴重影響了其藥理作用的發揮，限制了其臨床應用。?

針對上述問題，研究人員采用了各種藥物傳遞技術來提高其療效，諸如采用不同的給藥途徑、不同的藥物緩釋控釋技術、不同高分子材料的修飾等。而目前研究最為廣泛和成熟的是聚乙二醇[Poly(ethylene?glycol)，PEG]修飾技術。PEG具有良好的生物相容性，高度的親水性，在水溶液中具有較大的水動力學體積，且無免疫原性。PEG修飾技術主要是通過PEG的端基活化后與蛋白藥物或多肽上的殘基基團進行反應形成PEG-蛋白偶聯物。實驗證明，PEG偶聯的蛋白質藥物或多肽可以延長蛋白質藥物在體內的半衰期，降低其免疫原性和抗原性；另外還可以減弱蛋白酶的水解作用，增加蛋白分子的可溶性等。?

目前關于PEG修飾白介素-2的研究報道中，PEG的分子量大都采用5kDa~10kDa，所得到的偶聯物是多修飾產物，均一性比較差，且活性損失較大，不易控制質量和放大生產。一般來說，分子量越小，在相同反應條件下的修飾率越高，對產物活性的影響也就越大。而采用分子量較大的PEG修飾時，由于會受到空間位阻作用，所得到的偶聯產物將較為均一，且產物的活性損失也比較小。?

發明內容

本發明實施例的目的在于提供一種聚乙二醇修飾的重組人白介素2的制備方法，旨在解決PEG修飾重組人白介素2時出現的偶聯產物均一性比較差，且活性損失較大的問題。?

本發明實施例是這樣實現的，一種聚乙二醇修飾的重組人白介素2的制備方法，包括以下步驟：?

用活化劑將單甲氧基聚乙二醇(mPEG)活化，得到單甲氧基聚乙二醇活化分子；?

將該單甲氧基聚乙二醇活化分子與重組人白介素2在pH為7.5~9.0的緩沖液中反應，然后加入甘氨酸溶液終止該反應，將反應產物分離純化，?

其中該活化劑選自：琥珀酸酐和N-羥基琥珀酰亞胺、對甲苯磺酸氯、N,N'-?羰基二咪唑、N,N'-二琥珀酰亞胺基碳酸酯、對硝基苯碳酸酯、苯并三唑碳酸酯、苯基琥珀酰亞胺碳酸酯、乙酸-N-琥珀酰亞胺酯。?

本發明實施例還提供一種由本發明的方法制備的聚乙二醇修飾的重組人白介素2。?

本發明的制備方法采用大分子量的mPEG來修飾重組白介素-2上的氨基殘基，該方法步驟簡單，易于操作，合成效率高，易于控制質量和放大生產。通過本發明的制備方法制得的聚乙二醇修飾的重組人白介素2能夠保留較高的抗病毒活性，同時與未修飾的rhIL-2相比，其免疫原性較低，體內半衰期延長，血清清除率低，無需多次給藥，而且本發明制備的mPEG-rhIL-2，其分子量均一性較好。?

具體實施方式

為了使本發明要解決的技術問題、技術方案及有益效果更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。?

本發明實施例提供一種聚乙二醇修飾的重組人白介素2的制備方法，包括以下步驟：?

S01用活化劑將mPEG活化，得mPEG活化分子；?