[發明專利]形成用于電子顯微鏡的玻璃化樣本

有效

• 申請號: 201310048814.8
• 申請日: 2013-02-07
• 公開（公告）號: CN103247506B
• 公開（公告）日: 2017-08-15
• 發明（設計）人: J.J.L.穆爾德斯;R.J.P.G.沙姆珀斯;P.H.F.特龍佩納爾斯
• 申請（專利權）人: FEI公司
• 主分類號: H01J37/20
• 分類號: H01J37/20;H01J37/30
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司72001
• 代理人: 俞華梁,王忠忠

技術領域

本發明涉及形成玻璃化樣本的圖像的方法，該方法包括：

-提供包括樣本材料的水溶液，

-在表面上噴射水溶液，

-通過冷卻溶液來凝固溶液，

-形成帶電粒子顯微鏡的樣本室中的樣本材料的圖像。

背景技術

從H.D.White等人的“A second generation apparatus for time-resolved electron cryo-microscopy using stepper motors and electrospray”(J. Struct. Biol 144 (2003)，第246-252頁，又稱作White [-1-])已知這種方法。

在研究(成像、分析)透射電子顯微鏡(TEM)中的樣本時，具有可選能量(例如在60 keV與300 keV之間)的高能電子束照射樣本。樣本應當充分薄，使得電子的較大部分通過樣本以便成像/探測。成像例如可包括對熒光材料上的電子進行成像，或者對包括例如CCD或CMOS芯片的探測器上的電子進行成像。如本領域的技術人員已知，能夠通過對樣本掃描高能帶電粒子(電子、離子、絡離子)束并且觀測響應碰撞帶電粒子而從樣本出現的輻射，來執行類似的成像或分析。這種研究隨后在配備有掃描電子顯微鏡(SEM)鏡筒和/或聚焦離子束(FIB)鏡筒的設備的真空樣本室中執行。

對于生物材料，需要研究例如電子顯微鏡的惡劣環境中、即真空中并且在高輻射級別下的組織。為此，樣本材料常常冷卻到低溫溫度。將生物材料冷卻到低溫溫度涉及到不只是冷卻材料，因為冷卻通常通過形成冰針而引起對樣本材料(細胞、細菌、病毒等)的損壞。如本領域的技術人員已知，樣本材料應當嵌入作為非晶態冰的玻璃化冰中。通過以大約10⁵ K/s的速率將水溶液冷卻到小于大約165 K的玻璃轉變溫度的溫度來形成玻璃化冰。作為一個備選方案，在大約2100巴的壓力下以“僅”大約600 K/s的冷卻速率來執行玻璃化。當冷卻速率較低時，更厚的玻璃化樣本能夠在這個所謂的高壓冷凍(HPF)過程中形成。

例如通過在載體、例如TEM網片上涂敷水溶液的薄層，來形成玻璃化冰中的低溫樣本。多余的水隨后通過吸出(blotting)去除，并且具有水溶液的其余載體隨后投入諸如乙烷或液態氮之類的低溫流體中。執行這種方法的設備的示例是以名稱Vitrobot在市場銷售的，并且由FEI 公司(Hillsboro，OR，USA)制造。

在White [-1-]所描述的方法中，當載體(仍然在室溫下)正移動以便投入低溫流體中的同時，在載體上噴射包括樣本材料的水溶液：這樣，過程能夠被停止，因為它們在載體上噴射之后不久被凍結。

本發明意在提供形成低溫樣本的備選方法。

為此，按照本發明的方法的特征在于，噴射溶液的表面具有低溫溫度，因此，在微滴碰撞表面的時刻在該表面上形成玻璃化樣本，并且當處于帶電粒子顯微鏡的樣本室中的同時微滴被噴射在低溫表面上。

本發明基于如下認識：在低溫表面上噴射小微滴時，微滴足夠迅速冷卻，以便凝固成非晶態冰，因而形成玻璃化樣本。當原地(在帶電粒子顯微鏡中)進行這個操作時，樣本迅速地制備并且處于沒有冰能夠在這時低溫的樣本上生長的環境中。

要注意，估計對于直徑大于10 μm的微滴，微滴的至少一部分的冷卻過慢而無法形成玻璃化冰。優選地，因此，微粒的一部分應當具有小于10 μm、更優選地小于2 μm的直徑。例如，微滴的準確最大尺寸取決于(例如)諸如甘油、乙二醇或者某些防凍蛋白質之類的低溫防護劑的存在。在這種低溫防護劑存在的情況下，直徑可以更大。

要注意，在碰撞時，大概圓形微滴變形成具有更大面容比和較小‘厚度’的形狀，因而增強冷卻速率。

在按照本發明的方法的一個實施例中，在樣本架上噴射水溶液，樣本架通過與低溫保持裝置相接觸來保持在低溫溫度。

樣本架、例如TEM網片或SEM柱腳架優選地通過低溫保持裝置來保持，因此，樣本架冷卻到低溫溫度。這樣，樣本能夠在樣本架上制備，然后樣本架能夠從保持裝置移開，以便交換用于形成另一個樣本的另一個樣本架。

樣本架能夠采用例如靜電力來附連到保持裝置。但是，也可使用其它附連方法，例如夾持。

在一個優選實施例中，樣本架是裝備成用于電子顯微鏡中的樣本架。

在這個實施例中，樣本架是用于SEM(常常稱作柱腳架)或者TEM的所謂網片中的樣本架。