[發(fā)明專利]具有抗紫外輻射功能的小球藻類金屬硫蛋白的實(shí)驗(yàn)方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310047697.3
• 申請(qǐng)日: 2013-02-06
• 公開（公告）號(hào): CN103114123A
• 公開（公告）日: 2013-05-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃志勇;楊洪
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 集美大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/02
• 分類號(hào): C12Q1/02
• 代理公司: 廈門市新華專利商標(biāo)代理有限公司 35203
• 代理人: 朱凌

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種具有抗紫外輻射功能的小球藻類金屬硫蛋白的實(shí)驗(yàn)方法。

背景技術(shù)

隨著現(xiàn)代生活水平的提高，人們?cè)絹碓疥P(guān)注紫外輻射的問題。越來越多的抗紫外輻射化妝品也隨之誕生。目前市場(chǎng)上抗紫外輻射的產(chǎn)品其主要成分為多糖類、多酚類、黃酮類、膠原蛋白和植物蛋白（如藻藍(lán)蛋白）等。

抗紫外輻射的試驗(yàn)可采用動(dòng)物模型，如文鏡在《營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)》2001,?23?(1):44-47報(bào)道的給小白鼠連續(xù)灌胃金屬硫蛋白（MT）30?天后分別接受7?Gy、8?Gy?⁶⁰Co-γ一次性輻照或每周一次1?Gy小劑量連續(xù)8次輻照，通過采血測(cè)定白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等指標(biāo)以判斷金屬硫蛋白是否具有抗紫外輻射的作用，發(fā)現(xiàn)口服MT具有一定的抗紫外輻射功能。這種直接通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的方法，準(zhǔn)確性高，但測(cè)試過程繁瑣。抗紫外輻射的另一種試驗(yàn)方法是采用活體細(xì)胞模型。例如，Takeshi?Saito在Japanese?Journal?of?Ophthalmology,?54(5):486-493中報(bào)道的通過建立Lens?Epithelial?細(xì)胞模型來研究金屬硫蛋白的抗紫外輻射作用。與此類似的方法如黃敏鈞在《廣東茶業(yè)》,2010,4:30-33中報(bào)道的通過NIH/3T3細(xì)胞模型研究了普洱茶的抗紫外輻射作用。研究表明，用細(xì)胞模型進(jìn)行抗紫外輻射試驗(yàn)具有簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確和快速等優(yōu)點(diǎn)。

迄今已發(fā)現(xiàn)許多藻類多糖具有抗紫外輻射的功能，但是對(duì)藻類蛋白的抗紫外輻射研究還較少涉及，特別是藻類類金屬硫蛋白的抗紫外輻射功能還未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種具有抗紫外輻射功能的小球藻類金屬硫蛋白的實(shí)驗(yàn)方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)解決方案是：

本發(fā)明是一種具有抗紫外輻射功能的小球藻類金屬硫蛋白的實(shí)驗(yàn)方法，它包括以下步驟：

（1）活體細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化3-8?min后，加入4?mL含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞；

（2）在24孔板中各加入0.3?mL細(xì)胞懸浮液，于37℃及5%?CO₂氣氛的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24?h；

（3）取出24孔板，此時(shí)細(xì)胞完全貼壁，棄上清液，加入以pH?7.4的PBS為介質(zhì)的小球藻類金屬硫蛋白制品0.3?mL，在距離紫外燈管25?cm處輻射0-9?J/cm²；

（4）棄上清液，加入37℃預(yù)熱的新鮮DMEM培養(yǎng)基并放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12?h；

（5）棄上清液，往各孔加入2?mg/mL的MTT溶液0.1?mL，繼續(xù)培養(yǎng)2?h后，加入0.5?mL?DMSO溶液，充分溶解后各取0.2?mL溶液放入96孔板中，用酶標(biāo)儀測(cè)定570?nm處的吸光度值；

（6）以pH?7.4的PBS溶液?0.3?mL替代小球藻類金屬硫蛋白制品進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)，通過比較試驗(yàn)組和對(duì)照組的吸光度值說明小球藻類金屬硫蛋白的抗紫外輻射能力。

所述的小球藻類金屬硫蛋白的試驗(yàn)濃度范圍為1.25~10?mg/mL。

所述的活體細(xì)胞為NIH/3T3細(xì)胞，它包括以下步驟：

（1）NIH/3T3細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化3?min后，加入4?mL含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞；

（2）在24孔板中各加入0.3?mL細(xì)胞懸浮液，于37℃及5%?CO₂氣氛的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24?h；

（3）取出24孔板，此時(shí)細(xì)胞完全貼壁，棄上清液，加入以pH?7.4的PBS為介質(zhì)的小球藻類金屬硫蛋白制品0.3?mL，在距離紫外燈管25?cm處輻射6?J/cm²；

（4）棄上清液，加入37℃預(yù)熱的新鮮DMEM培養(yǎng)基并放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12?h；

（5）棄上清液，往各孔加入2?mg/mL的MTT溶液0.1?mL，繼續(xù)培養(yǎng)2?h后，加入0.5?mL?DMSO溶液，充分溶解后各取0.2?mL溶液放入96孔板中，用酶標(biāo)儀測(cè)定570?nm處的吸光度值；

（6）以pH?7.4的PBS溶液?0.3?mL替代小球藻類金屬硫蛋白制品進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)。通過比較試驗(yàn)組和對(duì)照組的吸光度值說明小球藻類金屬硫蛋白的抗紫外輻射能力。

所述的活體細(xì)胞為HaCaT細(xì)胞，它包括以下步驟：

（1）HaCaT細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化8?min后，加入4?mL含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞；