[發明專利]擬南芥硝酸鹽轉運體基因NRT3.1及其編碼蛋白與應用

在審

• 申請號: 201310047443.1
• 申請日: 2013-02-06
• 公開（公告）號: CN103667310A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 徐江;徐小棟;東方陽;魯黎明;王西瑤;張少斌;遲志海;洪雪;麻艷超;趙明;丁在松;付金東
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院作物科學研究所
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C07K14/415;A01H5/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

所屬技術領域：

本發明屬于植物分子生物學與轉基因相關技術領域。具體為擬南芥硝酸鹽轉運體(Nitrate?transporters，NRTs)家族關鍵基因NRT3.1在低氮脅迫下的反應和作用機理，以及該基因在營養高效植物新品種培育中的應用。

背景技術：

氮是植物必需的營養元素之一，是植物體內蛋白質、核酸、葉綠素、酶等的組成成分。氮素供應不足會影響植物的生長發育，限制農作物的產量；而氮肥施用過量則使氮素利用率下降，不僅造成資源浪費，而且引起環境污染。通過挖掘植物自身遺傳潛能，克隆耐低氮和氮素營養高效的基因，并利用轉基因技術培育氮素利用效率提高的新品種是解決這一問題的重要途徑之一。

擬南芥(Arabidopsis?thaliana)屬十字花科、蕓薹屬植物，它不僅是第一個完成基因組序列測定的模式植物(Athanasios?Theologis.et?al.，Nature，2000，408：791-826)，而且具有植株小，生長周期短，種子數量多，基因組小且易于進行遺傳轉化，自花授粉而又易于雜交等優點。因此在植物分子生物學及轉基因相關技術領域中，擬南芥被作為模式植物廣泛加以研究和應用。

硝酸鹽轉運體(Nitrate?transporters，NRTs)是一類專司硝態氮吸收、運輸的轉運蛋白。研究發現擬南芥基因組中存在3個NRT基因家族：NRT1、NRT2和NRT3，其中NRT3基因家族包含2個成員(NRT3.1和NRT3.2)。前人的研究證明NRT3.1基因為硝酸鹽高親和性吸收轉運體，在低氮素條件下，該基因的敲除突變體生長明顯弱于野生型(Mamoru?Okamoto.et?al，Plant?Physiology，March2006，Vol.140，pp.1036-1046)。但至今還未見低氮條件下該基因調控地上部生物量的報道。

發明內容：

本發明提供一個擬南芥硝酸根離子高親和性轉運體基因，以及該基因對低氮脅迫的反應和生理機制。

所提供的硝酸鹽高親和性轉運體基因為NRT3.1(AT5G50200)。

上述基因具有SEQ?ID?No.1的堿基序列。

上述基因編碼的蛋白質具有SEQ?ID?No.2的氨基酸序列。

NRT3.1基因的T-DNA插入突變體CS876661是從ABRC(Arabidopsis?Biological?Resource?Center)定購獲得。通過PCR鑒定獲得純合插入突變體，通過RT-PCR在mRNA水平上鑒定基因的敲除情況。

通過上述鑒定，獲得NRT3.1基因T-DNA插入突變體CS876661的純合株系，并以之為材料進行低氮處理，觀察低氮表型并拍照。然后對低氮處理后的擬南芥幼苗進行耐低氮相關指標的測定，包括：地上部干重測量，根部和地上部含氮量統計等。

附圖說明：

圖1顯示野生型和突變體PCR和RT-PCR檢測的電泳結果，結果表明獲得了NRT3.1基因T-DNA插入突變體株系CS876661的純合插入株系，其轉錄本被敲除。

圖2顯示野生型和突變體低氮處理7天的表型照片，結果表明在0.1mMNO₃^-的培養條件下，突變體比野生型更早白化死亡，表現低氮敏感表型。

圖3顯示野生型和突變體低氮處理7天的地上部干重統計，結果表明在0.1mM?NO₃^-的培養條件下，突變體地上部干重極顯著小于野生型(P＝0.002)。

圖4顯示0.1mM?NO₃^-處理后野生型和突變體根部和地上部含氮量差異，結果表明突變體根部和地上部含氮量均極顯著低于野生型(P＝0.001，P＝0.009)。

具體實施方式：

下面結合實驗方法和數據進一步闡述本發明。

1.擬南芥幼苗培養：

野生型和突變體種子分別用0.5％次氯酸鈉溶液浸泡消毒10min，消毒后的種子放入4℃冰箱春化2天后點布于含1％瓊脂的MS(Murashige?and?Skoog)固體培養基上，置于22℃光照培養箱中萌發生長。

2.純合突變體的鑒定：