[發(fā)明專利]重組乳鐵蛋白二肽、表達(dá)載體及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310047435.7
• 申請(qǐng)日: 2013-02-06
• 公開（公告）號(hào): CN103145848A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱登高;蔣正芳;鐘誠
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海高龍生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C07K19/00
• 分類號(hào): C07K19/00;C12N15/62;C12N15/81;A23K1/16
• 代理公司: 上海開祺知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31114
• 代理人: 費(fèi)開逵

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種重組乳鐵蛋白二肽、表達(dá)載體及其應(yīng)用，具體涉及一種根據(jù)畢赤酵母密碼子的偏好性優(yōu)化重組的乳鐵蛋白二肽和包含該重組乳鐵蛋白二肽的表達(dá)載體及其構(gòu)建，以及將該重組乳鐵蛋白二肽作為一種新型綠色飼料添加劑在動(dòng)物飼料中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

抗生素作為抗菌促生長(zhǎng)添加劑加到飼料中由來以久，但其廣泛和大量使用導(dǎo)致動(dòng)物性食品中藥物殘留等問題愈來愈令人擔(dān)憂。限制抗生素的使用已不可逆轉(zhuǎn)，如何尋找抗生素的替代品已成為各國動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)家最為關(guān)注的焦點(diǎn)。因此尋找一種安全、環(huán)保的新型飼料添加劑已成為當(dāng)務(wù)之急。

近年來，乳鐵蛋白（Lactoferrin，簡(jiǎn)稱LF）成為當(dāng)今乳品界和食品界最為關(guān)注的“熱點(diǎn)”之一。大量研究表明：乳鐵蛋白具有抗菌、抑菌、抗病毒、抗氧化和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等作用，可用于開發(fā)新型的保健食品和綠色飼料添加劑。乳鐵蛋白活性多肽是乳鐵蛋白在酸性條件下的降解產(chǎn)物，其抗菌活性明顯提高。

牛乳鐵蛋白肽（LfcinB）是從乳鐵蛋白的N-端（17-41）被胃蛋白酶水解下來的25個(gè)氨基酸殘基的小肽，分子量3100Da，序列為FKCRR?WQWRM?KKLGA?PSITC?VRRAF。其中的11個(gè)氨基酸殘基（RR?WQWRM?KKL）具有與完整的LfcinB相同的抗菌活性，11個(gè)氨基酸殘基中的6個(gè)（RR?WQWR）是LfcinB的活性中心。

另一種乳鐵蛋白活性多肽Lactoferrampin（Lfampin）來源于乳鐵蛋白N端的第265-284位氨基酸，序列為DLIWKLLSKAQEKFGKNKSR，分子量2389Da，研究表明其具有與LF、LfcinB相似的生物學(xué)活性，即抗菌、抗病毒、抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)、消炎及參與免疫反應(yīng)等。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)小分子多肽乳鐵蛋白二肽Lfchimera（由LFcinB17-30和LFampin265-284組合而成，序列為N-FKCRRWQWRMKKLG-K-RSKNKGFKEQAKSLLKWILD-N，分子量4422Da）具有比LFcinB17-30、LFampin265-284及其1:1混合物更強(qiáng)的抑菌活性，同時(shí)作用時(shí)間更短（<15min），也能耐受更高的鹽度（>100mM?NaCl）。

隨著多肽化學(xué)合成技術(shù)日趨完善，利用多肽自動(dòng)合成儀可以準(zhǔn)確合成一定氨基酸順序的多肽，該技術(shù)用于少量合成Lfcin及其多種衍生物，是研究Lfcin活性與結(jié)構(gòu)關(guān)系、明確Lfcin作用機(jī)制、調(diào)節(jié)Lfcin的功能以及開發(fā)具有特定功能與性質(zhì)的Lfcin衍生物的重要方法與手段。但該方法合成的Lfcin價(jià)格十分昂貴，僅使用于實(shí)驗(yàn)室的小量制備。

利用基因工程生產(chǎn)乳鐵蛋白活性多肽具有廣闊的應(yīng)用前景，利用DNA合成儀直接合成編碼該多肽的DNA，并構(gòu)建表達(dá)載體，在乳腺反應(yīng)器或微生物中高效表達(dá)具可行性。但由于乳鐵蛋白活性多肽抗菌譜廣，宿主表達(dá)的活性多肽可能會(huì)對(duì)微生物宿主本身產(chǎn)生反饋性抑制作用，達(dá)不到高效表達(dá)的理想結(jié)果；因此構(gòu)建表達(dá)體系的同時(shí)，要考慮篩選具有一定抗性的宿主微生物，這雖然增加了基因工程生產(chǎn)的難度，但因生物技術(shù)的迅速發(fā)展，仍不失為實(shí)現(xiàn)乳鐵蛋白活性多肽產(chǎn)業(yè)化最有希望的途徑之一。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種優(yōu)化后的高活性重組乳鐵蛋白二肽、表達(dá)載體及其應(yīng)用。

為了使乳鐵蛋白二肽基因Lfchimera在重組畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中更高效的轉(zhuǎn)錄、翻譯、表達(dá)，本發(fā)明根據(jù)畢赤酵母密碼子的偏好性，將現(xiàn)有的乳鐵蛋白二肽Lfchimera（GenBank:X54801.1，SEQ?ID?No.1）中的酵母低頻密碼子優(yōu)化成高頻密碼子，進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，并經(jīng)PCR擴(kuò)增進(jìn)行人工合成。經(jīng)序列測(cè)定，優(yōu)化后的重組乳鐵蛋白二肽Lfchimera的堿基序列如SEQ?ID?NO.2所示，其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.3所示。

其中，所設(shè)計(jì)的引物序列如下：

上游引物P1：5’-GGCGAATTCTTTAAGTGTCGACGATGGCAATGGA-3’

下游引物P2：5’-GGCGCGGCCGCATCCAAAATCCACTTAAGAAGAGAC-3’