[發明專利]用于檢測E2A-PBX融合基因相對表達量的試劑盒

無效

• 申請號: 201310046821.4
• 申請日: 2013-02-05
• 公開（公告）號: CN103131777A
• 公開（公告）日: 2013-06-05
• 發明（設計）人: 周曉犢;徐建成;王淑一;孫翠蓮
• 申請（專利權）人: 南京艾迪康醫學檢驗所有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務所有限公司 33100
• 代理人: 黎雙華

技術領域

本發明屬生命科學和生物技術領域，特別是一種基因檢測試劑盒，采用探針實時熒光定量PCR技術，能夠對急性淋巴細胞白血病患者體內E2A-PBX融合基因表達水平進行檢測，可有效的節約檢測時間，提高檢測精度。

背景技術

急性淋巴細胞白血病(Acute?Lymphoblastic?Leukemia，ALL)是由惡性淋巴細胞克隆性增殖、積累、并有組織浸潤所致的一類惡性血液病。其中t(1;19)(q23;pl3)易位形成的E2A/PBX1融合基因見于5%左右的兒童，尤其是在B細胞性ALL中占20～25%。t(1;19)使位于19p13的E2A和1q23上的PBX1相融合。完整的E2A作為轉錄因子包括轉錄激活結構域和HLH結構域，E2A有促進轉錄激活的作用。過去認為E2A/PBX1融合基因陽性的ALL患兒在發病時常伴有高白細胞計數，中樞神經系統白血病(central?nervous?system?leukemia，CNSL)發生率高。過去曾經認為攜帶有t(1;19)易位的兒童或成人白血病預后不好,但是近年的研究提示對于攜帶有t(1;19)易位的ALL兒童采用更為強烈的化療方案,可以改善其預后,5年無病生存率(EFS)已接近80%。

目前已公認,早期治療反應是重要的預后因素。通常采用MRD水平反映患兒的早期治療反應情況。對于MRD水平高(即早期治療反應差)、具有高度復發傾向的患兒采取較強的方案,以減少復發,提高治愈率。而對MRD水平低(即早期治療反應好)、具有低度復發傾向的患者,則可采用較弱的化療方案,以減少因化療引起的毒副作用及經濟負擔,提高患者的生存質量。已有很多利用定性RT-PCR，擴增e2a-pbx1融合基因,進行白血病微小殘留病檢測的報道,檢測靈敏度達到10^-4-10^-5。但所有這些研究均未能顯示出明確的臨床意義。目前國際上得到普遍認同,誘導緩解治療第33天時的MRD水平能夠提示ALL患者的遠期預后。

在實際應用中，用于檢測E2A-PBX融合基因表達水平的方法主要為熒光原位雜交，盡管該法較為直觀，但是試驗過程過于繁瑣，需要的試劑種類繁多，費時費力，且試驗結果需要經驗豐富的專家來判讀，結果判讀存在較大的主觀性，因而一定程度上限制了該法的應用。

實時熒光定量PCR法具有較高的靈敏度和特異性,而且能對PCR進行實時檢測,可準確反映患者體內E2A-PBX的表達情況，節約了大量的檢測時間,還避免了殘留污染的發生。常見的方法有SYBR?GreenI染料法，雙探針雜交法以及Taqman技術等。其中SYBR?GreenI由于是非飽和染料，特異性不如雙探針雜交法以及Taqman法，必須通過觀察溶解曲線來判斷其特異性；而雙探針法雜交法成本又較為昂貴。因此本研究采用實時熒光PCR技術結合Taqman探針法應用于E2A-PBX的基因檢測。

發明內容

鑒于現有技術中檢測E2A-PBX融合基因的不足，本發明設計了檢測內參/目的基因用引物、探針序列，用熒光定量PCR技術檢測E2A-PBX融合基因相對表達量。通過調整兩個基因的引物探針濃度及比例，優化PCR的反應體系和反應條件，開發了一種用于檢測白血病E2A-PBX融合基因相對表達量的試劑盒。

用于檢測E2A-PBX融合基因相對表達量的試劑盒，包括紅細胞裂解液、TRIzol、氯仿、無水乙醇、ReverTraAce?qPCR?RT?Kit、檢測體系PCR反應液、陽性對照品和陰性對照品，其特征在于：

檢測體系PCR反應液包括THUNDERBIRD?qPCR?MIX、檢測目的基因用上下游引物E2A-PBX-F，E2A-PBX-R，探針為E2A-PBX-Probe，檢測內參基因Abl用引物abl-F，abl-R，探針abl-Probe；其中，

E2A-PBX-F：GGCAGCCACCCCGAGGACG

E2A-PBX-R：TCTGTGGGTTCCTCCTCCTGG

E2A-PBX-Probe：FAM-CCTCCCCAGCCAGCCAGGCACCCT-TAMRA

abl-F：GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG

abl-R：ATGATATAGAACGGGGGCTC

abl-Probe：FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA。

進一步地，檢測目的基因用上下游引物和探針的比例優選為：E2A-PBX-F、E2A-PBX-R、E2A-PBX-Probe的摩爾比為2︰2︰1。