[發明專利]一種小麥胚芽抗腫瘤蛋白的制備方法

有效

• 申請號: 201310046768.8
• 申請日: 2013-02-05
• 公開（公告）號: CN103087169A
• 公開（公告）日: 2013-05-08
• 發明（設計）人: 朱科學;周會會;郭曉娜;周惠明;彭偉
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C07K14/415
• 分類號: C07K14/415;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/30;C07K1/18;C07K1/16
• 代理公司: 蘇州慧通知識產權代理事務所(普通合伙) 32239
• 代理人: 丁秀華

技術領域

本發明涉及一種抗腫瘤蛋白的制備方法，特別涉及一種小麥胚芽抗腫瘤蛋白的制備方法，屬于小麥精深加工技術。

背景技術

小麥胚芽是面粉加工的副產物，我國的小麥粉生產量巨大，因此小麥胚芽的產量也很可觀。小麥胚芽除了含有較高的優質蛋白外，還含有維生素E、鎂、泛酸、磷、硫胺素等，是一種難得的天然健康食品資源。

人們從植物中發現了很多種抗腫瘤活性蛋白，國外有研究者從小麥胚芽發酵提取物中分離得到多肽類成分，并證明其具有抗腫瘤效果。小麥胚芽蛋白和多肽的抗氧化、抗衰老、抗疲勞等生理活性得到國內外學者的廣泛關注，其抗腫瘤活性報道很少。有報道認為小麥胚芽水溶性提取物能明顯抑制S-180肉瘤的生長，同時提高荷瘤小鼠免疫器官的重量，并可使荷瘤小鼠的腹腔巨噬細胞活性得到恢復，提高小鼠巨噬細的吞噬能力，且水提取物對MDA-MB231細胞生長有明顯的抑制效應，但是究竟是何種成分起作用，并不清楚。由于脂溶性提取物、鹽溶性提取物及發酵提取物中不可避免的溶劑殘留和活性成分不明確，給以小麥胚芽為原料開發抗腫瘤保健食品或藥物帶來一定的不確定性，并且不能高效地實現小麥胚芽資源的增值轉化。

發明內容

本發明的目的主要在于提供一種小麥胚芽抗腫瘤蛋白的制備工藝，其以水作為提取液，天然健康，不僅不會導致所獲小麥胚芽蛋白中留存有毒有害物質，還有利于提升所獲小麥胚芽蛋白的多種生理活性，使其對人乳腺癌細胞株MDA-MB231的生長表現出顯著增殖抑制活性以及對正常細胞細胞的低毒性，從而克服了現有技術中的不足。

為實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下：

一種小麥胚芽抗腫瘤蛋白的制備工藝，包括：

(1)取新鮮小麥胚芽進行低溫脫脂、粉碎處理，而后以水作為溶劑進行提取操作；

(2)去除步驟(1)所獲混合提取液中的不溶物，并以硫酸銨對所獲上清液進行分級沉淀，其后分離出沉淀物，再將沉淀物復溶于水中進行透析處理，之后依次進行濃縮、冷凍干燥處理，獲得小麥胚芽水溶性蛋白；

(3)將所述小麥胚芽水溶性蛋白溶于緩沖液中，并依次進行離子交換層析和凝膠過濾層析處理，獲得目標產物。

作為較為優選的實施方案之一，步驟(1)包括：以低溫萃取方式對小麥胚芽進行脫脂處理至小麥胚芽粕中的殘油值在2.0wt％以下；

所述低溫萃取包括超臨界二氧化碳萃取、四號溶劑加壓萃取或有機溶劑低溫萃取。

所述有機溶劑可選自但不限于正己烷、石油醚或丙酮。

所述低溫是指溫度在40℃以下。

作為較為優選的實施方案之一，步驟(1)包括：將脫脂后的小麥胚芽粕粉碎后過80-100目篩獲得脫脂麥胚粉，其后按照10∶1(v/w)的液料比將水與脫脂麥胚粉混合，并攪拌提取，形成混合提取液。

作為較為優選的實施方案之一，步驟(2)包括：對步驟(1)所獲混合提取液進行離心處理，分離出其中的不溶物，同時收集上清液，并分步緩慢加入硫酸銨至上清液中停止析出沉淀物，而后離心分離出所述沉淀物，再將沉淀物復溶于水中，之后依次進行透析、濃縮和冷凍干燥處理。

前述的“分步”是指先緩慢添加硫酸銨至相對較低的飽和度狀態，將鹽析出的蛋白分離除去，然后再添加硫酸銨達到相對較高的飽和度狀態，再離心分離出鹽析蛋白，藉此得到比較純的目標蛋白，剔除雜蛋白，這也是分步階梯鹽析。

尤為優選的，步驟(2)還包括：將所述不溶物再次以水進行提取操作，其后再次離心分離出不溶物，并再次收集上清液，之后加入硫酸銨進行分步分級沉淀，所述分步分級沉淀的過程包括：

室溫條件下，加入硫酸銨到上清液至15-20％飽和度，析出蛋白，離心棄之，收集上清液再加入硫酸銨至20-40％飽和度，收集所得析出蛋白組分。

尤為優選的，步驟(2)中的離心操作均采用低溫離心操作，所述低溫離心操作的條件包括：轉速為8000r/min以上，溫度在0～4℃，時間為20min以上。

作為較為優選的實施方案之一，步驟(3)包括：將所述小麥胚芽水溶性蛋白溶于Tris-HCl緩沖液中，并依次過DEAE-Sepharose?FF離子交換層析柱和Superdex20010/300_GL凝膠過濾層析柱，獲得目標產物。

作為較為優選的實施方案之一，步驟(3)中所述離子交換層析處理及凝膠過濾層析處理的條件包括：以緩沖液作為洗脫液，并且所述洗脫液的流速分別為1.0～2.0mL/min、0.2～0.5mL/min。