[發明專利]一種檢測酵母老化的方法

無效

• 申請號: 201310046580.3
• 申請日: 2013-02-05
• 公開（公告）號: CN103131750A
• 公開（公告）日: 2013-06-05
• 發明（設計）人: 趙長新;尹亞輝;劉寶祥;安文濤;張銘振;曲晶
• 申請（專利權）人: 大連工業大學
• 主分類號: C12Q1/26
• 分類號: C12Q1/26;C12Q1/00;C12R1/865
• 代理公司: 大連東方專利代理有限責任公司 21212
• 代理人: 趙淑梅;李馨

1.一種檢測酵母老化的方法，其特征在于對酵母菌體進行傳代培養，得到不同代數的酵母細胞發酵液，將酵母發酵培養液通過離心分離得到酵母細胞，酵母細胞經冷凍干燥后，稱取一定量凍干的細胞用破壁緩沖液溶解，超聲破碎，破碎后的酵母細胞冷凍離心，取上清液測定SOD活性以及超氧陰離子自由基生成速率和含量；

具體的操作步驟如下：

第一步、培養酵母細胞，其中：

1)培養基：磷酸氫二鉀10.5g，磷酸二氫鉀4.5g，硫酸銨1g，檸檬酸三鈉0.5g，葡萄糖60g，無氨基酵母氮源培養基6.7g，組氨酸10mg，甲硫氨酸20mg，色氨酸20mg，1000ml去離子水；

2)培養條件：按照3～8×10⁶cfu/mL的接種量接種，在28～30℃，150～180r/min條件下培養到發酵終點，發酵結束；

3)從固體斜面培養基上的菌種轉接到液體培養基定義為第一代酵母，到達發酵終點后，以5.05×10⁶cfu/mL的接種量轉接一次，進行傳代；

4）收集細胞：發酵液在4000r/min條件下離心20分鐘，用無菌水清洗3～5次，每次4000r/min，離心10分鐘，得到干凈的酵母細胞，通過冷凍干燥（-48℃,4Pa），得到凍干的酵母，備用；

其中所述的發酵終點為培養基中的殘糖含量在1～3mg/mL時；

第二步、對酵母細胞采用反復凍融超聲破壁，稱取2g凍干的酵母，用30ml的破壁緩沖液溶解，在-20℃下冷凍4h，于30℃下溶解0.5h，反復兩次，進行超聲破碎，超聲破碎時工作2s，間歇3s，全程時間25min，功率400w，保護溫度4℃，破碎后的混合液冷凍離心，離心速率10000r/min，離心時間10min，保護溫度4℃，取上清液，立即進行測定；

其中，破壁緩沖液配方是每1000ml中含有：50mmol/L的Tris-HCl，1.491gKCl，0.146gEDTA；

第三步、采用鄰苯三酚自養化的方法和羥胺氧化法測定細胞提取液中SOD活性以及超氧陰離子自由基生成速率和含量，分析三者之間的相互關系，建立SOD活性與超氧陰離子自由基含量和產生速率之間的標準關系曲線，進而根據標準曲線，已知SOD活性，查到酵母的代數。