[發(fā)明專利]抗紋枯病基因關(guān)聯(lián)抗病同源序列及其分子標(biāo)記獲取方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310046578.6
• 申請日: 2013-02-05
• 公開（公告）號: CN103146690A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 任鄄勝;曾禮華;任光俊;高方遠;陸賢軍;吳賢婷
• 申請（專利權(quán)）人: 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/10
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11246
• 代理人: 龔燮英

1.抗紋枯病基因關(guān)聯(lián)抗病同源序列及其分子標(biāo)記獲取方法，其特征在于，該獲取方法包括：引物及其序列、水稻抗紋枯病關(guān)聯(lián)RGA引物及其產(chǎn)生的抗病同源序列片段以及相對應(yīng)的抗病同源序列在Rice?Genome?Annotatation?Project上的注釋號、編碼的蛋白質(zhì)。

2.如權(quán)利要求1所述的抗紋枯病基因關(guān)聯(lián)抗病同源序列及其分子標(biāo)記獲取方法，其特征在于，引物及其序列、水稻抗紋枯病關(guān)聯(lián)RGA引物及其產(chǎn)生的抗病同源序列片段以及相對應(yīng)的抗病同源序列在Rice?Genome?Annotatation?Project上的注釋號、編碼的蛋白質(zhì)具體為：

3.如權(quán)利要求2所述的抗紋枯病基因關(guān)聯(lián)抗病同源序列及其分子標(biāo)記獲取方法，其特征在于，抗紋枯病基因關(guān)聯(lián)抗病同源序列及其分子標(biāo)記獲取方法如下：

RGA引物設(shè)計，根據(jù)檢索到的全基因組抗病同源序列，利用引物設(shè)計軟件PrimerPremier6設(shè)計了水稻全基因組RGA引物；

178份全球核心種質(zhì)RGA基因型鑒定，用CTAB法提取137份全球核心種質(zhì)的DNA，用1.中設(shè)計的備選RGA標(biāo)記178份全球核心種質(zhì)進行RGA基因型分析，PCR反應(yīng)在NBI?Veriti9600擴增儀上進行，擴增產(chǎn)物在6%的聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分析，并記錄帶型；

178份全球核心種質(zhì)抗紋枯病表型，利用紋枯病病菌微管快速鑒定技術(shù)，對178份核心種質(zhì)接種鑒定；抗性對照品種為Jasmine85，感病對照品種為Lemont；每個品種選3株，設(shè)三次重復(fù)；當(dāng)感病品種Lemont的發(fā)病指數(shù)達90%時，記錄每個品種的發(fā)病情況；

分子性狀關(guān)聯(lián)分析，利用單分子標(biāo)記分析方法進行分子性狀關(guān)聯(lián)分析，取P≤0.001，獲得RGA4、RGA218、RGA320、RGA378、RGA470、RGA50和RGA468與紋枯病抗性相關(guān)聯(lián)；

關(guān)聯(lián)RGA標(biāo)記相對應(yīng)抗病同源序列測序及比對，利用關(guān)聯(lián)RGA標(biāo)記對紋枯病抗感種質(zhì)進行克隆測序。

4.如權(quán)利要求3所述的抗紋枯病基因關(guān)聯(lián)抗病同源序列及其分子標(biāo)記獲取方法，其特征在于，關(guān)聯(lián)RGA標(biāo)記相對應(yīng)抗病同源序列測序及比對，利用關(guān)聯(lián)RGA標(biāo)記對紋枯病抗感種質(zhì)進行克隆測序具體過程如下:

抗病同源序列克隆PCR擴增體系50μl：1μl?DNA,10×buffer5μl，10mM?dNTP2μl,10μM引物各3μl，高保真Taq酶0.5，超純水35.5μl；

PCR反應(yīng)程序：94℃5min;95℃20s,57℃45s,72℃1min,共35個循環(huán)；然后72℃延長7min；最后4℃保存；

PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖電泳分離，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段。再將用將目的片段構(gòu)建到寶生物工程有限公司生產(chǎn)的PMD19T質(zhì)粒載體，然后將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌DH5α中，最后送樣測序。

5.如權(quán)利要求2所述的抗紋枯病基因關(guān)聯(lián)抗病同源序列及其分子標(biāo)記獲取方法，其特征在于，序列比對分析

序列RGA742共588bp，通過在線軟件對抗感種質(zhì)的PCR片段比對發(fā)現(xiàn)兩者存在9個堿基缺失；編碼一個144個氨基酸的P-loopNTPase超級家族；通過比對，RGA74-2與LOC_Os01g52550在30253614bp之間95%的同源；

序列RGA2183共807bp，編碼一個119個氨基酸，通過DNAMAN6.0對抗感種質(zhì)的PCR片段比對發(fā)現(xiàn)兩者在蛋白質(zhì)序列中存在1個氨基酸突變；通過比對，RGA2183與LOC_Os09g11020有三處共37個堿基缺失，在2871062bp之間89%的同源；

序列RGA3202共978bp，編碼一個259個氨基酸；通過比對，RGA3202與LOC_Os07g09900在30173916bp之間99%的同源；

序列RGA3783共873bp，編碼一個202個氨基酸。通過DNAMAN6.0對抗感種質(zhì)的PCR片段比對發(fā)現(xiàn)兩者在蛋白質(zhì)序列中存在3個氨基酸突變；通過比對，RGA3783與LOC_Os12g30070在20802758bp之間99%的同源；

序列RGA4703共1383bp，編碼一個290個氨基酸。通過DNAMAN6.0對抗感種質(zhì)的PCR片段比對發(fā)現(xiàn)兩者在蛋白質(zhì)序列中存在兩個氨基酸突變；通過比對，RGA4703與LOC_Os12g03750在26503630bp之間99%的同源；

序列RGA50-2共1654bp，編碼一個415個氨基酸的NBS蛋白家族。通過DNAMAN6.0對抗感種質(zhì)的PCR片段比對發(fā)現(xiàn)兩者在蛋白質(zhì)序列中存在7個氨基酸插入/缺失突變；通過比對，RGA502與LOC_Os12g17490在16733326bp之間99%的同源；

序列RGA4682共1189bp，通過DNAMAN6.0對抗感種質(zhì)的PCR片段比對發(fā)現(xiàn)兩者在堿基序列上存在插入/缺失突變；通過比對，RGA4682與LOC_Os12g32680在16322535bp之間98%的同源。