[發明專利]重組鯉魚PKCδ基因、蛋白及其制備與檢測方法和應用

有效

• 申請號: 201310046511.2
• 申請日: 2013-02-06
• 公開（公告）號: CN103060347A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發明（設計）人: 周小秋;姜維丹;馮琳;姜俊;劉揚;李樹紅
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N9/12;C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 成都行之專利代理事務所(普通合伙) 51220
• 代理人: 譚新民

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種重組鯉魚PKCδ基因、蛋白及其制備與檢測方法和應用。

背景技術

蛋白激酶C?(Protein?kinase?C,?PKC)與許多細胞生物效應有關,?在細胞信息傳遞中具有重要作用。由于P?K?C?是促癌劑佛波酯在細胞內的高親和力受體,?因而在腫瘤發生發展中的作用引起人們重視,?已發現多種腫瘤組織中PKC含量高于正常。

到目前為止，在哺乳動物組織內已確定10種PKC亞類（8-3），分為A、B、C三組，A組稱為典型或傳統的PKC（classicalor?conventional?PKC,CPKC），包括α、βI、βⅡ和?γ亞類，其中βI和βⅡ有高度的同源性，是由同一mRNA的不同剪接而成，A組成員分子量在76-78kDa。B組為新型PKC（atypical?PKC,aPKC），包括δ、ε、η（L）和θ亞類，分子量在77-83kDa。C組為非典型PKC（atypicalPKC,aPKC），由ζ和λ亞類組成，分子量較小為67kDa。其中，PKCδ在調控人和鼠肝細胞生長和抗氧化中起著重要作用。

迄今，關于PKCδ在哺乳動物細胞生長、增殖和抗氧化中發揮調節作用的研究已在人、大鼠、小鼠等哺乳動物的細胞中開展，并取得了許多成果，但未見有鯉魚PKCδ基因的cDNA核苷酸序列和與它對應的氨基酸序列的報道。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種重組鯉魚PKCδ基因、蛋白及其制備與檢測方法和應用。

本發明解決上述問題所采用的技術方案是：一種重組鯉魚PKCδ基因，為下述序列之一：1)序列表中SEQ?ID?No：1所示的基因序列；2)?將SEQ?ID?NO?:1所示的基因序列經過一個或幾個堿基的取代、缺失或添加且與SEQ?ID?No：1所示的基因序列表達的氨基酸序列相同的基因序列。

一種重組鯉魚PKCδ氨基酸序列，為下述序列之一：1)?SEQ?ID?NO?:2所示的由權利要求1所述重組鯉魚PKCΔ基因所表達的氨基酸序列；2)將SEQ?ID?NO?:2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且與具有與SEQ?ID?NO?:2的氨基酸序列相同活性的由SEQ?ID?NO?:2序列衍生的蛋白質。

一種上述重組鯉魚PKCδ基因的制備方法，包括下述步驟：

1）采集鯉魚的總RNA并以其腸道組織總RNA為模板進行反轉錄操作，得到cDNA第一鏈；

2）以步驟1）中的cDNA第一鏈為模板，利用引物P1、P2進行PCR擴增，得到SEQ?ID?NO?:1所示的序列，所述引物P1具有SEQ?ID?NO?:3所示的序列，引物P2具有SEQ?ID?NO?:4所示的序列；所述步驟2）中以Pl、P2為引物，利用DNA聚合酶進行PCR反應的50μl?PCR擴增體系中各組分及其比例為：cDNA第一鏈，2.5?μl；50μM?的P1，0.25μl；50μM的P2，0.25μl；10×LA?PCR?Buffer?II?(Mg²⁺?Plus)，5.0μl；each?2.5?mM?的dNTP?Mixture，8.0μl；ddH₂O，33.5μl；5?U/μl的DNA聚合酶，0.5μl；反應循環條件：94℃預變性1min；94℃變性30sec，60℃退火30?sec，72℃延伸2?min，共40個循環；最后72℃延伸?10?min，反應完成。

一種上述制備的重組鯉魚PKCδ基因的檢測方法，包括下述步驟：

1）將P1和P2?的PCR回收產物的PCR擴增采用2×Taq?PCR?MasterMix進行，50μl?PCR擴增體系中各組分及其比例為：50倍稀釋的PKCδ回收產物，1.0μl；50μM的P3，0.25μl；50μM?的P4，0.25μl；2×Taq?PCR?MasterMix，25.0μl；ddH₂O，23.5μl；反應循環條件：94℃預變性1min；94℃變性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸1min，共35個循環；最后72℃延伸5?min，反應完成；所述P3具有SEQ?ID?NO?:5所示的序列，引物P4具有SEQ?ID?NO?:6所示的序列；

2）取5μl?PCR產物用1.0%瓊脂糖凝膠在100V，10?min的條件下進行電泳檢測，凝膠成像系統觀察分析結果。

具體地，該檢測方法中，所述50倍稀釋的PKCδ回收產物指重組鯉魚PKCδ基因cDNA編碼區核苷酸序列的制備方法中所制備的重組鯉魚PKCδ基因cDNA序列。