[發明專利]抗肌抑素單鏈抗體及其編碼基因、表達載體、重組轉化子和應用

無效

• 申請號: 201310046330.X
• 申請日: 2013-02-07
• 公開（公告）號: CN103145836A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發明（設計）人: 牛冬;吳兵兵;袁陶燕;齊瑞利;何俊
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C07K16/22
• 分類號: C07K16/22;C12N15/13;C12N15/63;C12N1/21;A61K39/395;A61P21/00;A61P43/00
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 胡紅娟

技術領域

本發明涉及生物工程領域，尤其涉及一種抗肌抑素單鏈抗體及其編碼基因、表達載體、重組轉化子和應用。?

背景技術

畜禽肉產品是人類主要動物性食品之一。隨著人們生活水平的不斷提高，消費者對畜禽肉產品的需求日益增加。提高動物產肉性能一直是動物生產研究人員所努力的目標。但目前通過傳統的遺傳改良和營養調控手段來提高動物生產性能已很難再有大的進展。為了提高動物的生產性能，在飼料中添加各種違禁藥物造成食物中毒甚至死亡的事件時有發生，因而研究一種安全、高效、對人類無毒副作用的提高動物生產性能的制劑或產品是目前養殖業所面臨的迫切問題。?

人類骨骼肌萎縮是目前世界上比較常見的肌肉疾病，肌肉萎縮可發生于多種生理、病理條件下，如衰老，惡病質，燒傷，肌肉廢棄等，主要表現為肌肉體積的縮小，肌細胞數量的減少，肌細胞內蛋白質含量降低等。?

動物的產肉性能或人的肌肉發育總是由促進和抑制兩類激素或因子聯合控制的。如果把免疫學的方法應用于動物或人肌肉發育的調控，選擇對肌肉發育有抑制作用的激素或因子作為研究對象，體外制備這些激素或因子的抗體，對動物或人進行被動免疫，從而抑制或減弱該類激素或因子的生理功能，進而提高動物的產肉性能或治療人類肌肉萎縮。?

肌抑素（Myostatin，MSTN，GenBank號：NM_005259.2）又稱GDF-8（Growth?Differentiation?Factor8，生長分化因子8），屬于TGF-β超家族，其僅在骨骼肌中特異表達并分泌至血漿中，是影響骨骼肌生長發育的抑制因子。?

肌抑素首先以一個376個氨基酸組成的前體非活性形式產生，含有N端的前體肽和C端成熟肽，經兩步蛋白酶切后，兩個C端亞基通過一個多肽鏈分子間二硫鍵形成一個具生物學活性的雙亞基成熟肌抑素，同時兩?個亞基的其余半胱氨酸殘基形成經典的半胱氨酸結。成熟肽的氨基酸序列在人類、小鼠、大鼠、豬、牛、羊、馬、雞和狗間的同源性均是100%。?

該基因的敲除使小鼠的骨骼肌增加了近3倍。該基因的敲除使小鼠的骨骼肌增加了近3倍。該基因天然缺失的比利時藍牛被稱為“雙肌牛”。該基因的缺失只影響骨骼肌的發育，對心肌、平滑肌等沒有任何影響，不對動物的其它性能產生危害，牛自然狀態下的雙肌現象證明了這一點。因而肌抑素阻斷劑在農業畜禽生產方面具有巨大的應用前景。同時，由于阻斷肌抑素信號通路還有望緩解許多疾病伴隨的肌肉萎縮癥狀，因此肌抑素阻斷劑同樣在肌肉萎縮藥物研究方面具有重要的應用前景。目前已經有關于肌抑素結合蛋白或其通路阻斷劑的研究，以期用于農業及醫藥生產。這些肌抑素拮抗劑包括：肌肉抑制劑結合蛋白、外源競爭性可溶肌抑素受體、肌抑素特異性單克隆抗體、肌抑素抗原蛋白、針對肌抑素的RNAi和DNA疫苗等。但上述拮抗劑均存在分子量大、組織穿透性差、免疫原性強等不足之處，在使用多次后會引發動物或人產生特異免疫反應，從而大大限制了其運用。而RNAi和DNA疫苗的穩定性和安全性差，應用效果不理想。?

通過抗體工程技術來克服上述不足，用完全人源化或者畜禽來源的序列構建單鏈抗體或單結構域抗體，可以消除潛在的抗免疫球蛋白的特異免疫反應。單鏈抗體由于其分子量小而具有較強的組織穿透力，免疫原性也比單克隆抗體的大大降低，進而極大地減少了產生抗免疫球蛋白特異免疫反應的可能性。同時由于單鏈抗體與抗原的結合位點沒有改變，其抗體親和力不會因為分子量降低而變弱。此外，單鏈抗體還可通過常規基因重組技術在體外工程菌等生物反應器大量獲得，與單克隆抗體生產相比大大降低了成本，因此無論在治療人類肌肉萎縮及提高動物生產性能方面均具有很好的應用前景。?

目前關于單鏈抗體的研究主要是針對細菌或病毒的抗原，通過制備相應的單鏈抗體來中和這些致病細菌或病毒。細菌或病毒是原核生物，其表達的膜抗原等結構簡單，針對這些抗原的單鏈抗體的制備也較方便。但高等動物的內源性激素或因子往往是蛋白肽鏈經過各種折疊及二硫鍵相連等形成的具高級結構的多維蛋白，如肌抑素單體蛋白必須通過二硫鍵形成二聚體后才有生物活性。因此目前尚未發現針對內源性激素的單鏈抗體的?相關研究。?

發明內容

本發明提供了一種抗肌抑素單鏈抗體，免疫原性低，與肌抑素親和力強，并可在大腸桿菌中高效表達。?

一種抗肌抑素單鏈抗體，包括重鏈可變區、輕鏈可變區和連接肽，所述重鏈可變區的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，所述輕鏈可變區的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。?