[發明專利]線粒體全基因組DNA擴增、引物、測序及突變檢測

有效

• 申請號: 201310046250.4
• 申請日: 2013-02-05
• 公開（公告）號: CN103173441A
• 公開（公告）日: 2013-06-26
• 發明（設計）人: 費凌娜;尉姍姍;高景紅;葉李莉;田玉嬌;易鑫
• 申請（專利權）人: 深圳華大基因研究院
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 深圳鼎合誠知識產權代理有限公司 44281
• 代理人: 羅瑤

1.用于擴增線粒體全基因組序列的引物對組，其特征在于：所述引物對組包括以下A-H中的至少一對引物，優選含有A-H中的所有八對引物，?

a、seq?ID?No.1:5’-CACTCCCATACTACTAATCTC-3’,?

seq?ID?No.2:5’-TAGCATGTACTGCTCGGAGGT-3’,?

b、seq?ID?No.3:5’-GTCCTAAACTACCAAACCTGC-3’,?

seq?ID?No.4:5’-GTGTTAGTCATGTTAGCTTG-3’,?

c、seq?ID?No.5:5’-ATCTCTCCCTCACTAAACGTAAG-3’,?

seq?ID?No.6:5’-ATGAGGGCGTGATCATGAAAGGT-3’,?

d、seq?ID?No.7:5’-GCATACACCACATGAAACATC-3’,?

seq?ID?No.8:5’-ATGCCGTCGGAAATGGTGAAG-3’,?

e、seq?ID?No.9:5’-TCCCACTCCTAAACACATCC-3’,?

seq?ID?No.10:5’-AAACCCGGTAATGATGTCGG-3’,?

f、seq?ID?No.11:5’-GCCCACGGGCTTACATC-3’,?

seq?ID?No.12:5’-GATTGTTAGCGGTGTGGTCG-3’,?

g、seq?ID?No.13:5’-GCCTTCTTACGAGCCAAAACC-3’,?

seq?ID?No.14:5’-TCCAGCGTCTCGCAATGCTAT-3’,?

h、seq?ID?No.15:5’-TTCGCCTACACAATTCTCCG-3’,?

seq?ID?No.16:5’-TTTATGGGGTGATGTGAGCC-3’。?

2.一種線粒體全基因組DNA擴增方法，所述方法包括，采用權利要求1所述的引物對組，以線粒體DNA為模板，進行PCR擴增。?

3.根據權利要求2所述的線粒體全基因組DNA擴增方法，其特征在于：所述PCR擴增時，各引物對的退火溫度為52-56℃，優選為56℃。?

4.一種線粒體全基因組測序方法，所述方法包括，采用權利要求2或3所述的方法擴增得到線粒體全基因組DNA，構建測序文庫，采用高通量測序平臺進行全基因組測序。?

5.根據權利要求4所述的線粒體全基因組測序方法，其特征在于：所述高通量測序平臺為Miseq測序儀。?

6.根據權利要求5所述的線粒體全基因組測序方法，其特征在于：所述測序方法包括，將PCR擴增得到的產物分別純化并混合后，制備DNAPaired-End?PCR?Free文庫，制備好的文庫質檢合格后在Miseq測序儀上直接測序檢測。?

7.根據權利要求6所述的測序方法，其特征在于：所述制備DNAPaired-End?PCR?Free文庫具體包括，?

i、將所述PCR產物打斷，使打斷后DNA主帶集中在目的片段大小范圍；?

ii、將步驟i的產物進行末端修復；?

iii、將步驟ii的產物進行3’端加A堿基；?

iv、將步驟iii的產物片段加上測序接頭；?

v、選擇并回收目的DNA片段，獲得所述DNA文庫；?

任選地，所述目的片段為100～1000bp，優選為400～600bp，更優為500bp。?

8.一種線粒體DNA的突變檢測方法，所述方法包括，采用權利要求4-6任意一項所述的方法進行線粒體全基因組測序，獲得線粒體全基因組DNA序列，將測序結果與線粒體參考序列比對。?

9.根據權利要求8所述的突變檢測方法，其特征在于：所述線粒體參考序列為修正后的劍橋參考序列NC_012920.1。?

10.一種試劑盒，所述試劑盒含有權利要求1所述的引物對組。?

11.根據權利要求10所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒用于線粒體全基因組DNA擴增。?