[發(fā)明專利]棉花的基因槍活體快速轉(zhuǎn)化方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310046202.5
• 申請日: 2013-02-05
• 公開（公告）號: CN103070067A
• 公開（公告）日: 2013-05-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 葉武威;王德龍;陰祖軍;王俊娟;王帥;樊寶香;王桂峰;孔靜靜;宋貴方;張德超;陸許可
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所
• 主分類號: A01H1/02
• 分類號: A01H1/02;A01H1/00
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種棉花的基因槍活體快速轉(zhuǎn)化方法。

背景技術(shù)

在迄今發(fā)展起來的棉花轉(zhuǎn)基因技術(shù)中,農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化應(yīng)用最為廣泛。自1987年Umbeck等通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功獲得珂字棉轉(zhuǎn)基因植株后,農(nóng)桿菌介導(dǎo)法逐漸成為國際上最普遍的轉(zhuǎn)化手段,并且取得很大進展。中國農(nóng)科院棉花研究所成功建立了20多個棉花品種的高效、穩(wěn)定的規(guī)?；D(zhuǎn)化體系，實現(xiàn)了流水線操作,建立了高效、工廠化的棉花轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系。盡管農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是理論和實踐都較為完善的一種轉(zhuǎn)化技術(shù),且已被廣泛用于雙子葉植物的轉(zhuǎn)化,但該方法受宿主基因型范圍的限制,很多優(yōu)良品種（系）很難以此法進行轉(zhuǎn)化，并且轉(zhuǎn)化程序煩瑣復(fù)雜?；ǚ酃芡ǖ擂D(zhuǎn)化法雖然沒有基因型、種屬控制,但其轉(zhuǎn)化技術(shù)不太完善,對轉(zhuǎn)化機制缺乏系統(tǒng)的研究,常局限于開花期才能應(yīng)用。因此，需要發(fā)展出有效的基因轉(zhuǎn)化方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個目的是提供一種對棉花進行基因轉(zhuǎn)化的方法。

本發(fā)明所提供的對棉花進行基因轉(zhuǎn)化的方法，包括如下步驟：

（1）利用基因槍轟擊的方法，將子彈轟入父本棉花的花粉中；所述子彈中含有外源基因；

（2）將基因槍轟擊后的父本花粉授粉到活體母本棉花中；

（3）授粉后的母本棉花所結(jié)的種子便是轉(zhuǎn)基因棉花種子，實現(xiàn)了棉花的基因轉(zhuǎn)化。

上述方法中，所述步驟（1）中，所述父本棉花的花粉是先從父本棉花中收集下來再進行基因槍轟擊的。

上述方法中，所述基因槍轟擊的方法為：將0.2-0.5克花粉均勻鋪至花粉槽底部，然后進行基因槍轟擊，基因槍的轟擊參數(shù)為30Psi（轟擊壓力）+6cm（轟擊距離）。

上述方法中，所述子彈按照如下方法制備：

將30mg金粉與500μl水混合，得到金粉懸浮液；

將100μl金粉懸浮液與10μl濃度為1mg/ml的插入外源基因的載體溶液混合，得到金粉與基因的混合液；

向金粉與基因的混合液中逐滴加入40μl0.1mol／L亞精胺，并混勻，逐滴加入100μl2.5mol/L?CaCl₂，混勻；離心，去上清，收集沉淀；

向所述沉淀中加入200μl無水乙醇重懸，離心，去上清，收集沉淀；

向所述沉淀中加入100μl無水乙醇，得到基因槍轟擊子彈。

上述方法中，所述基因槍轟擊中，每槍使用10μl子彈。

上述方法中，所述基因槍為美國wealtec的型號為GDS-80的基因槍。

本發(fā)明方法無需組織培養(yǎng)步驟，直接在活體棉花上便實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)化。而且本發(fā)明方法通過第三代便攜式基因槍和優(yōu)化轉(zhuǎn)化的參數(shù)使活體轉(zhuǎn)化時對花蕾和花粉形成微創(chuàng)傷，大大縮短了獲得轉(zhuǎn)基因植株的周期。本發(fā)明方法實用、易操作、不依賴組織培養(yǎng)、穩(wěn)定性好。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實施例、

1、含有外源基因的重組載體的制備

外源基因是GhTrx基因。

含有外源基因的重組載體的構(gòu)建：用XmaⅠ和BamHⅠ酶切載體pBI121，收集載體大片段；將載體大片段和基因片段用T4連接酶進行連接，得到重組載體。

2、基因槍子彈制備：

金粉處理

（1）取30mg金粉置于離心管中，加入lml70%乙醇，充分振蕩3－5min，靜置15min，

（2）以12000rpm離心30s，去上清，

（3）加入lml無菌水重懸以12000rpm離心5s，去上清，

（4）重復(fù)上述步驟5-7次，將金粉懸浮于500μl無菌蒸餾水中，置4℃或室溫下儲存。

DNA的處理

（1）取100μl金粉懸浮液，加入10μl的質(zhì)粒DNA(1mg/ml)溶液。

（2）0.1mol／L亞精胺(所用的溶液經(jīng)無菌消毒)、2.5mol/L?CaCl₂和無水乙醇冰浴。逐滴加入40μl0.1mol／L亞精胺，并混勻。逐滴加入100μl2.5mol/L?CaCl₂，振蕩1min。

（3）以12000rpm離心30s，去上清，加入200μl無水乙醇重懸金粉，振蕩30s，以12000rpm離心30s，去上清。

（4）加入100μl無水乙醇重懸金粉，可供10槍(每槍10μl)使用。

3、基因槍轟擊