[發明專利]用于豬繁殖與呼吸系統綜合征病毒培養的細胞株及其應用

有效

• 申請號: 201310046123.4
• 申請日: 2013-02-05
• 公開（公告）號: CN103966157A
• 公開（公告）日: 2014-08-06
• 發明（設計）人: 張許科;孫進忠;白朝勇
• 申請（專利權）人: 普萊柯生物工程股份有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N7/00;C12R1/91;C12R1/93
• 代理公司: 北京聿宏知識產權代理有限公司 11372
• 代理人: 吳大建;劉華聯

技術領域

本發明屬于畜牧類生物制藥技術領域，涉及一種用于豬繁殖與呼吸系統綜合征病毒培養的細胞株，以及該細胞株在豬繁殖與呼吸系統綜合征病毒培養中的應用。

背景技術

豬繁殖與呼吸系統綜合征是由豬繁殖與呼吸系統綜合征病毒（Porcin reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一種豬的高度傳染性疾病，又稱豬藍耳病。本病以妊娠母豬的繁殖障礙（流產、死胎、木乃伊胎）及各種年齡豬特別是仔豬的呼吸道癥狀為特征。該病自1987年在美國被發現以來，曾經迅速傳遍世界各個養豬國家，在豬群密集、流動頻繁的地區更易流行，造成了嚴重的經濟損失。近幾年，該病在我國呈現明顯的高發趨勢，能引起不同品種、不同日齡、不同飼養管理模式的保育豬、仔豬和懷孕豬高發病率、高死亡率，給我國的養豬業造成了不可估量的損失。

PRRSV病毒的穩定性受PH和溫度的影響較大，在PH小于5或大于7的條件下，其感染力降低95%以上；在PH7.5的培養液中可于-20℃和-80℃長期保存，在4℃則緩慢失去感染力；對有機溶劑敏感，對常用的化學消毒劑抵抗力不強。

PRRSV病毒能在多種細胞上生長，但Marc145是目前各實驗室培養PRRSV最常用的細胞。用Marc145細胞接種豬繁殖與呼吸系統綜合征病毒，細胞病變以聚集為特征，由于細胞病變死亡，病毒無法繼續繁殖，經過反復凍融收獲病毒液，病毒液只能收獲一次，收獲量小，病毒滴度低，強毒病毒含量在10^6.0~10^7.0TCID₅₀/ml，弱毒毒株病毒含量在10^8.0~10^8.5TCID₅₀/ml。可見，現有的Marc145細胞雖然適合PRRSV的增殖，但是病毒滴度比較低，病毒含量不能滿足疫苗和診斷抗原的制備。

因此，目前存在的問題是為了獲得關于疫苗、診斷試劑盒等治療手段的更全面信息，進行更加直接有效的研究，需要克隆出一株對PRRSV高度敏感且穩定，并能持續穩定增殖高滴度PRRSV的Marc145細胞株。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足，提供一種用于PRRSV培養的細胞株，該細胞株對PRRSV高度敏感且穩定，并能持續穩定增殖高滴度PRRSV。該細胞株無支原體、細菌、真菌、外源病毒的污染，并且不存在三致的危險，安全性高。

本發明還進一步提供了一種上述細胞株在豬繁殖與呼吸系統綜合征病毒培養中的應用。該細胞株較之Marc145母細胞更有利于PRRSV的復制與增殖，采用該細胞株進行高滴度PRRSV的增殖培養有利于獲得有關PRRSV研究與疫病防治方面的更全面信息，進行更加直接有效的研究。

為此，本發明提供了一種用于PRRSV培養的細胞株，其中，所述細胞株為猴腎細胞系Marc145-1株（Monkey kidney cell line strain Marc145-1），其保藏編號為:CCTCC NO:C2012185，保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏日期為2012年12月10日。上述培養為增殖培養。

本發明中，所用術語“猴腎細胞系Marc145-1株”是指從猴腎細胞系Marc145母細胞克隆獲得的新細胞株，也稱為Marc145-1細胞，簡稱Marc145-1。

本發明中，所述猴腎細胞系Marc145-1株具有以下特征：

（1）從形態上觀察，猴腎細胞系Marc145-1株比Marc145母細胞形態規則，細胞之間界限明顯，整齊，細胞折光性強，胞質飽滿，核質清晰。細胞易于傳代和瓶壁分離。細胞變小，密度增大。

（2）對PRRSV具有高敏感性；

（3）病毒增殖過程中細胞的病變特征表現為細胞崩解，收獲的病毒液為Marc145母細胞的4倍，病毒滴度提高1~2個滴度,并且這種敏感性可以穩定遺傳；

（4）細胞生長速度變快，倍增時間提前了1d（天）。

在本發明的一個具體實施方式中，所述猴腎細胞系Marc145-1株通過以下方法構建完成，其包括：

步驟一，Marc145細胞有限稀釋法克隆培養