[發明專利]一種測定重組腺相關病毒滴度的定量PCR方法

有效

• 申請號: 201310046098.X
• 申請日: 2013-02-04
• 公開（公告）號: CN103114152A
• 公開（公告）日: 2013-05-22
• 發明（設計）人: 許瑞安;王峰;崔秀靈
• 申請（專利權）人: 許瑞安
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 北京華科聯合專利事務所 11130
• 代理人: 楊厚;王為

技術領域:

本發明涉及定量實時熒光PCR檢測重組腺相關病毒滴度的方法。?

背景技術:

腺相關病毒（adeno-associated?virus，AAV）載體是含有單鏈的DNA，無包膜，屬于依賴輔助病毒的細小病毒B19家族。這種病毒是1965年Atchison等人在猿猴腺病毒15（SV-15）中發現并定義為腺相關病毒（AAV）。AAV在宿主中的復制需要宿主細胞或其他病毒的協助才能完成，如腺病毒和皰疹病毒，也因此被稱為腺相關病毒。AAV病毒顆粒直經大約20nm，呈二十面體，分子量約為5.5-6.2×10⁶道爾頓，在CsCl梯度中的密度為1.39-1.42g/cm。相較于其它病毒，腺相關病毒更加穩定，可以承受60度的溫度及離子去污劑的作用。AAV基因組為線性單鏈的正鏈或負鏈DNA，長度約為4700個核苷酸。腺相關病毒的基因組中含有兩個開放的閱讀框，rep和cap，兩端分別有末端重復序列（ITR）。?

重組腺相關病毒（rAAV）載體因其在體內外表達效率高、表達周期長、免疫性低、無致病和致瘤性、遺傳毒性低并可規模化生產等諸多優點,使其成為目前基因治療領域非常有前途的生物載體,現已被廣泛應用于臨床試驗且取得很好的療效。?

然而，迄今世界上還沒有形成統一的標準化的AAV滴度測定和臨床劑量使用標準，給不同實驗室臨床試驗結果間的比較造成了困難。目前國際基因治療中應用較多的另一種腺病毒，已由腺病毒標準樣品工作小組（Adenovirus?Reference?Material?Working?Group，ARMWG）根據5型腺病毒制定出標準樣品指南。其對腺病毒的滴度測定和基因治療中使用的劑量進行了統一規定。參照這一經驗，美?國食品藥品監督管理局（FDA）、美國國家健康研究所重組DNA顧問委員會（NIH-RAC）、美國國家基因載體實驗室和來自其他9個國家的科學家共同成立了AAV標準樣品工作小組（AAV?Reference?Standard?Working?Group，AAVRSWG），試圖建立起AAV的標準化指南。rAAV2是基因治療領域應用最早和最廣泛的亞型，也是目前物理、化學和生物性質研究得最清楚的AAV亞型。所以標準化指南首先建立在rAAV2的基礎上。該組織對rAAV2標準樣品統一測定時，要求被測定的rAAV2標準樣品，必須要達到在不同實驗室能進行不同測定所需的量，并具有一定時間內的穩定性。同時，規定了生產和純化rAAV2的標準指南。該組織確定，選擇四個方面進行測定實施對rAAV2的質量控制：（1）使用A20酶聯免疫吸附法測定rAAV2外殼滴度；（2）定量聚合酶鏈反應qPCR測定rAAV2的基因組滴度；（3）qPCR和增強綠色熒光蛋白（EGFP）表達測定感染滴度；（4）SDS-PAGE測定病毒純化和外殼蛋白。?

如所周知，rAAV的滴度是影響基因治療效果的重要因素。研究發現，臨床試驗對病毒生產的要求為10³和10⁵DRP/cell（DNA酶-抗性顆粒/細胞，DNase-Resistant?Particles/cell）。而臨床試驗中的劑量一般為2×10¹¹DRP/kg，需要的單批產量約為10¹⁵DRP。而且不同組織對rAAV的使用滴度要求有所不同。在眼科臨床試驗中，大約只需要2×10⁸DRP，而對肌肉或者肝臟疾病進行治療時卻需要1×10¹⁴DRP。目前涉及rAAV應用于臨床試驗的研究有81項。多數臨床研究處于臨床I期和II期，但是有8項臨床研究已經進入III期。臨床結果表明，基因表達量與rAAV的滴度成正比關系，而且大多數基因藥物的療效與表達量有很大關系，表達量太低達不到其起作用的藥物需求量。某些基因藥物高表達可能會導致正常功能的紊亂，從而對人體產生傷害。研究發現，rAAV對于某些病人會產生針對其外殼蛋白的免疫反應，包括抗原特異性記憶性CD8+T細胞、抗體和干擾素等。所以，rAAV的滴度測定對臨床試驗至關重要。而整個基因治療領域制定標準化的滴度測定方法，將使不同實驗室間臨床結果比較和藥物研發成為可能。目前測定rAAV滴度的方法主要檢測以下幾個方面：病毒顆粒滴度（Viral?Particles，V.P.），基因組滴度（viral?genome，V.G.），感染滴度（Infectious?Particles，?I.P.），轉導滴度（Transduction?Units，T.U.）或增強的轉導滴度（Enhanced?Transduction?Units，E.T.U.）。?