[發明專利]核酸純化柱系統及其在核酸提取中的應用

有效

• 申請號: 201310045866.X
• 申請日: 2013-02-05
• 公開（公告）號: CN103087903A
• 公開（公告）日: 2013-05-08
• 發明（設計）人: 林源吉;呂航
• 申請（專利權）人: 杭州百邁生物技術有限公司
• 主分類號: C12M1/12
• 分類號: C12M1/12;C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及生物樣品提取領域，尤其涉及一種核酸純化柱系統及該系統在核酸提取的應用。

背景技術

在生物學領域，經常需要對樣品進行過濾和純化。尤其是在分子生物學領域，經常需要提取生物樣品中的DNA、RNA等大分子物質，并對這些大分子物質進行分離純化。高效率地分離純化核酸物質成為分子生物學領域的關鍵技術。利用制備柱從生物樣品中分離和提取核酸已經成為分子生物學領域常用的手段。通常的制備柱為一個圓形的管狀結構，包括圓形管柱體，柱體的一端帶有密封蓋，另一端填充有多孔篩板或膜，在多空篩板上添加了能吸附核酸等生物物質的材料。常采用負壓法和離心法提取核酸。采用負壓法時，首先將制備柱插到負壓裝置的插口上，用核酸結合緩沖液溶解需要分離的樣品，如PCR產物、酶切、酶標或測序產物并轉移至制備柱中，開啟并調節負壓至-25-30英寸汞柱，緩慢吸走管中溶液。保持負壓，加入洗滌液對管中的殘留物進行洗滌后，將制備柱置于新離心管中，在制備柱膜中央加洗脫液或去離子水，室溫靜置1min后12,000×g離心1min洗脫核酸。采用離心法時，用核酸結合緩沖液溶解需要分離的樣品，如PCR產物、酶切、酶標或測序產物，混勻后轉移到制備柱中，將制備柱置于離心管中，12,000×g離心1min，棄濾液。將制備柱置回新的離心管，加洗滌液，12,000×g離心1min，棄濾液。再次將制備柱置于潔凈的離心管中，在制備柱膜中央加一定量的洗脫液或去離子水，室溫靜置1min后12,000×g離心1min洗脫得到核酸。現有的核酸提取技術中受到制備柱本身結構的影響，每經過一次洗脫或離心，制備柱都要重新置于新的離心管中，因此不同樣本之間的轉化步驟復雜。現有的制備柱相互之間是不能相互組合使用，因此不能滿足核酸提取的連續性操作。

發明內容

為克服現有技術的不足，本發明的目的在于提供核酸純化柱系統，至少包括兩個相互獨立又能上下位疊加在一起的生物樣品制備柱，所述生物樣品制備柱包括本體，本體的上部具有加樣口，本體的下部具有出樣管嘴，生物樣品制備柱的加樣口上部設置有一保持部件，其中居于上方的制備柱下部緊密扣合在居于下方的制備柱保持部件內。

優選的，居于下方的制備柱保持部件的內徑與居于上方的制備柱下部的外徑相同。

優選的，居于上方的制備柱的出樣管嘴的外周還包括固定框，所述固定框插入居于下方的制備柱保持部件內，該固定框的外徑與居于下方的制備柱的保持部件的內徑相同。

優選的，制備柱出樣管嘴包括出口端，所述出口端暴露在固定框外。

優選的，制備柱保持部件與本體的連接處還包括支撐面。

優選的，制備柱的本體內具有過濾膜或硅膠膜，或兩者的組合。

本發明還提供一種核酸純化柱系統在核酸提取中的應用，包括以下提取步驟：

1)取30ml在LB培養基中培養過夜的高拷貝數質粒菌液，或100ml過夜培養的低拷貝質粒/Cosmid菌液至于離心管中，以大于等于3,000×g離心8min，棄上清，棄上清；

2)加4.5ml的溶液I懸浮細菌沉淀；

3)加4.5ml溶液II，溫和并充分地上下翻轉6-8次混合均勻使菌體充分裂解，直至形成透亮的溶液；此步驟不宜超過5min；向透明溶液中加4.5ml4℃預冷的溶液III，溫和并充分地上下翻轉10次混合均勻，直至形成緊實的凝集塊；室溫放置5min；

4)利用本發明所述核酸純化柱系統，并將居于下方的生物樣品制備柱插到負壓裝置的插口上；將步驟3中所得溶液緩慢加入居于上方的制備柱中，開啟并調節負壓至-25至-30英寸汞柱，緩慢吸走制備柱中溶液；

5)待步驟4中的溶液吸干后，移除居于上方的制備柱，繼續保持負壓，向居于下方的制備柱中加5ml溶液IV，吸盡制備柱中溶液；

6)向居于下方的制備柱中加5ml溶液V，吸盡管中溶液；

7)將步驟6中的制備柱置于潔凈的15ml離心管中，加0.3ml溶液V，8,000×g離心5min；

8)將步驟7中的制備柱置于另一潔凈的15ml離心管中，加0.3ml洗脫液或去離子水，室溫靜置1min，8,000×g離心2min收集得到質粒DNA；

其中：

溶液I包括2mmol/L?KH₂PO₄，10mmol/L?Na₂HPO₄，137mmol/L?NaCl，2.7mmol/L?KCl，1％Tween20，pH6.0-8.0，加入RNa?s?e?A后，混合均勻，4℃貯存；