[發明專利]纖維素結合域在棒狀桿菌分泌表達系統中的應用

無效

• 申請號: 201310045414.1
• 申請日: 2013-01-28
• 公開（公告）號: CN103966252A
• 公開（公告）日: 2014-08-06
• 發明（設計）人: 趙志敬;蔣歡;胡廣
• 申請（專利權）人: 北大工學院紹興技術研究院
• 主分類號: C12N15/77
• 分類號: C12N15/77;C07K1/22
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• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于蛋白表達純化技術領域，具體為利用纖維素結合域作為親和標簽，快速純化棒狀桿菌分泌表達的重組蛋白的方法。本發明涉及以CBD為親和標簽的棒狀桿菌分泌表達載體的構建，以及利用纖維素柱純化棒狀桿菌所分泌的重組蛋白。

背景技術

棒狀桿菌是非病原性的革蘭氏陽性菌，常被用于生產各種商品化的氨基酸和維生素^[1-4]。經過多年突變育種，原生質體和表達載體的改良，有望用于大規模的蛋白生產^[5，6]。2006年，日本的Date等人利用谷氨酸棒狀桿菌在培養基中分泌表達出具有活性的人類表皮生長因子，說明該系統具有大規模生產活性蛋白的能力^[7]。以棒狀桿菌作為表達宿主有著極其明顯的優勢：1)遺傳背景清楚，擁有高效的分泌信號肽及分子伴侶系統，所分泌的重組蛋白大多具有天然構象和生物活性^[5]；2)有兩種分泌蛋白的途徑：除常規的分泌途徑，還可通過雙精氨酸易位(Twin-arginine translocation，Tat)途徑進行分泌，使所表達的蛋白直接分泌到培養基中，簡化純化步驟，降低生產成本^[8]；3)屬于革蘭氏陽性菌，不產生脂多糖等內毒素，安全性好；4)分泌的蛋白酶極少，幾乎不會對所表達的蛋白造成影響，即產物穩定^[5]；5)作為表達宿主時間久，人們積累了極其豐富的發酵經驗，嚴格好氧，生長迅速，培養條件簡單，使用安全，無致病性，所以谷氨酸棒狀桿菌是一種非常優良的工程菌株。

CBD(Cellulose-binding domain，CBD)是碳水化合物水解酶——纖維素酶的一個結合纖維素的蛋白域，可提高細菌或真菌的纖維素酶活^[9，10]。該蛋白域有若干個含芳香族氨基酸殘基的疏水表面，可親和吸附到纖維素表面的疏水區^[11-13]。利用親和標簽純化重組蛋白是生物工程中很常用的技術方法，常用的標簽有多聚組氨酸，谷胱甘肽巰基轉移酶，麥芽糖結合蛋白，鏈親和素，幾丁質結合域或者是它們的集合體等^[14，15]。能夠與纖維素發生可逆吸附的CBD也是其中之一，它較為獨立的空間結構對蛋白生物性能的干擾影響較小，而且纖維素作為吸附原料可以大幅降低分離成本^[16]。近年的一些研究已經成功應用CBD為純化標簽進行蛋白純化^[17-19]。

在谷氨酸棒狀桿菌的表達系統中，直接被分泌到胞外的目的蛋白可通過離心，透析，濃縮或親和層析等方法獲得。這些方法所使用的緩沖液及親和樹脂的高制造成本會加大蛋白純化的代價，而在大規模的生產應用中，成本往往是必須考慮的重要因素。本研究應用CBD標簽優化谷氨酸棒狀桿菌表達系統的純化工藝，試圖降低該系統的蛋白純化成本。

發明內容

本發明為一種分泌表達重組蛋白的純化方法，具體是以CBD為棒狀桿菌分泌表達系統的純化標簽，利用微晶纖維素作為柱層析填料對棒狀桿菌分泌的重組蛋白進行純化的方法，旨在優化蛋白表達的純化工藝，降低成本。涉及含親和標簽CBD的棒狀桿菌分泌表達載體的構建和用纖維素填料對分泌的重組蛋白進行純化。

本發明提供下述：

1、利用里氏木霉的纖維素結合域作為親和標簽，在棒狀桿菌的表達系統中進行分泌表達和純化重組蛋白的方法。所述方法包括以下步驟：

1)優化并合成編碼里氏木霉糖苷水解酶I的纖維素結合域(CBD)的DNA序列；

2)將步驟1合成的序列作為蛋白標簽序列克隆至棒狀桿菌分泌表達載體；

3)將目的蛋白序列插入至步驟2獲得的標簽載體；

4)將步驟3獲得的重組載體轉化至棒狀桿菌中進行蛋白的分泌表達；

5)以CBD為親和標簽，利用纖維素柱純化該重組菌分泌的重組蛋白。

2、權利要求1的方法中，步驟1)的纖維素結合域CBD來源于里氏木霉糖苷水解酶I的CBD及其連接肽，其氨基酸序列為SEQ ID NO：1。其中CBD的氨基酸序列為SEQ ID NO：2，連接肽的氨基酸序列為SEQ ID NO：3。

3、權利要求1的方法中，步驟2)的表達載體為棒狀桿菌的分泌表達載體，其分泌信號元件為谷氨酸棒狀桿菌來源的cgR蛋白的信號肽cgR-sp，其氨基酸序列為SEQ ID NO：4。

4、權利要求1中，步驟3)所述的目的蛋白可插入至CBD標簽的N端，也可以插入至CBD標簽的C端。