[發(fā)明專利]隨機(jī)突變改造的有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶及其編碼基因

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310044547.7
• 申請日: 2013-02-04
• 公開（公告）號: CN103146665A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張惠文;謝建飛;徐明愷;張成剛;石元亮;盧宗云
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所
• 主分類號: C12N9/16
• 分類號: C12N9/16;C12N15/55;C12R1/38
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標(biāo)代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及通過基因工程改造的有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶。

背景技術(shù)

農(nóng)藥殘留嚴(yán)重危害生態(tài)環(huán)境，危害人民群眾的身體健康，是各國都需要面對的嚴(yán)峻問題。研究發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)的地下水、農(nóng)作物及土壤都的遭受到了農(nóng)藥殘留的污染。我國是農(nóng)業(yè)大國，每年的農(nóng)藥使用量巨大，隨之而來的農(nóng)藥殘留問題也日趨嚴(yán)重。相關(guān)數(shù)據(jù)顯示我國農(nóng)產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留超標(biāo)嚴(yán)重，居民日常膳食中的各類農(nóng)藥攝入量高于發(fā)達(dá)國家數(shù)十倍。近年來，農(nóng)藥殘留的去除技術(shù)成為研究焦點(diǎn)，尋找一種安全、高效的去除農(nóng)藥殘留的方法具有重要意義。

農(nóng)藥降解酶是去除農(nóng)藥殘留的有效技術(shù)手段，具有降解迅速、使用安全、環(huán)境友好等特點(diǎn)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種農(nóng)藥降解酶，例如有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶OPH、有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶MPH、菊酯類農(nóng)藥降解酶B1等。其中，國內(nèi)外對于有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶研究的最為深入。有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶OPH最先在Flavobacterium?sp.ATCC27551（Mulbry?and?Karns,1989）和Pseudomonas?diminuta?MG（McDaniel?et?al.,1988）中分離得到，有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶MPH首先由我國學(xué)者在Plesiomonas?sp.strain?M6中發(fā)現(xiàn)（崔中利等,2001）。有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶OPH和MPH都具有廣泛的降解譜，可以降解甲基對硫磷、毒死蜱、對硫磷、殺螟硫磷、馬拉硫磷、敵敵畏等農(nóng)藥，是農(nóng)藥降解酶領(lǐng)域的關(guān)鍵酶。有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶OPH的基因改造工作進(jìn)行的比較深入，研究人員通過DNA?shuffling技術(shù)成功將有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶OPH對甲基對硫磷的降解活性提高了25倍（Catherine?Mee-Hie?Cho?et?al.,2002），對毒死蜱的降解活性提高了700多倍（Catherine?Mee-Hie?Cho?et?al.,2004），這些成功的基因改造使OPH擁有了更優(yōu)秀的酶學(xué)性質(zhì)，有利于其在農(nóng)藥殘留降解領(lǐng)域的應(yīng)用，具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

相對于有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶OPH，有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶MPH的基因改造并沒有獲得如此顯著的成果。研究人員通過定點(diǎn)突變，使有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶MPH獲得了更優(yōu)秀的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性（Jian?Tian?et?al.,2010;Yidan?Su?et?al.,2011；Lu?Huang?et?al.,2012）；通過隨機(jī)突變手段，獲得了一株突變位點(diǎn)為K173R的突變株，其對毒死蜱的降解效率比野生型酶提高了41.55%（李亞楠等，2012）。有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶MPH在基因改造方面的研究還有待于深入研究和開發(fā)，通過基因工程手段改造有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶MPH，獲得酶活力和熱穩(wěn)定性提高的突變體酶對于解決農(nóng)藥殘留問題具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于利用基因工程手段改造有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶MPH，使其獲得更加優(yōu)秀的酶活力和熱穩(wěn)定性。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶MPH的N端35個(gè)氨基酸為信號肽序列，本發(fā)明隨機(jī)突變的對象為不含信號肽編碼序列的成熟mpd基因。

采用易錯(cuò)PCR的方法對Pseudomonas?stutzeri?strain?ZK-5來源的有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶MPH編碼基因（mpd，GenBank登錄號：JQ686087）進(jìn)行隨機(jī)突變。

易錯(cuò)PCR反應(yīng)體系（50μL）為：mpd基因（GenBank登錄號：JQ686087）50ng作為模板，上游引物和下游引物各0.3μM，dNTPs各200μM，10μL突變緩沖液，5U?Taq?DNA聚合酶，5μLPCR緩沖液。易錯(cuò)PCR反應(yīng)條件為：94℃熱變性5min,94℃熱變性1min,55℃退火1min,72℃延伸1min,30個(gè)循環(huán)。

上游引物：5’-GAATTCTGCAGCACCGCAGGTGCGCACC-3’

下游引物：5’-TCCGGAAGCTTTCATCATCACTTGGGGTTGACGACCG-3’

突變緩沖液組成為：dTTP4mM,dCTP4mM,MgCl₂27.5mM,MnCl₂2.5mM，溶劑為去離子水。

PCR緩沖液組成為：100mM?Tris-HCl?pH8.3,500mM?KCl?and15mMMgCl₂，溶劑為去離子水。